泛素化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰形式,其在调节细胞周期、信号转导、DNA修复、炎症、抗原呈递等多种细胞生理过程中起到了关键作用。猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是具有囊膜的单股正链RNA病毒,主要引起感染仔猪严重的水样腹泻,给全球养猪业带来了严重的经济损失。目前有研究表明多种病毒的感染依赖于泛素化修饰,但其对PEDV增殖的影响报道较少。本论文以PEDV变异毒株AJ1102为代表,对泛素化修饰在PEDV增殖过程中的作用及其机制开展了研究。具体内容下:1.PEDV感染改变细胞内蛋白的泛素化修饰水平为了分析PEDV感染对细胞内蛋白的泛素化修饰水平的影响,将PEDV AJ1102株接种猪小肠上皮细胞(IPI-FX),并于接毒后不同时间点收RSL3纯度集样品,通过Western Blot实验检测细胞内蛋白的泛素化修饰水平。结果显示,与未感染对照细胞相比,在PEDV感染后的6-18 h,细胞内蛋白的泛素化修饰水平明显降低,而24 h时无显著差异,说明PEDV感染能够改变细胞内蛋白的泛素化修饰水平,且在病毒感染的早期和中期影响较明显。2.超表达泛素促进PEDV的增殖PEDV感染可以改变细胞内蛋白的泛素化修饰水平,提示细胞内蛋白的泛素化修饰可能参与调控PEDV的增殖。为了验证这一猜想,同时考虑到细胞内蛋白的泛素化修饰以K48和K63型最为常见,因此将野生型泛素及K48和K63型泛素的真核表达质粒分别转染IPI-FX细胞,然后接种PEDV AJ1102株,通过Western Blot和TCID_(50)实验检测病毒的增殖情况。结果发现,超表达3种类型的泛素均能够促进PEDV的增殖,并以K63型泛素的作用最为明显,说明细胞内蛋白的K63型泛素化修饰在PEDV增殖过程中的作用最为关键。3.泛素-蛋白酶体系统主要参与PEDV基因组的复制泛素-蛋白酶体系统(UPS)是降解细胞内泛素化修饰蛋白的主要途径,其是否参与PEDV的增殖过程尚不清楚。为此,使用UPS抑制剂MG132处理IPI-FX细胞,然后接种PEDV AJ1102株,通过Western Blot、RT-q PCR和Barasertib化学结构TCID_(50)实验检测病毒的增殖情况。结果显示,MG132呈剂量依赖性地抑制PEDV增殖。进一步分析发现,MG132主要抑制了PEDV基因组的复制,而对病毒吸附、侵入和释放环节无明显影响,说明UPS主要参与PEDV基因组的复制。4.超表达泛素影响部分PEDV编码蛋白的表达超表达泛素可以促进PEDV的增殖,为了探讨其对病毒编码蛋白的影响,将PEDV各编码蛋白的真核表达质粒分别与泛素的真核表达质粒共转染HEK-293T细胞,通过Western Blot实验检测PEDV各编码蛋白的表达量。结果显示,PEDV M蛋白Media coverage、nsp2、nsp7、nsp8、nsp9、nsp13和nsp16的表达量均有所增加,并以nsp16表达量的增加最为明显,说明超表达泛素能够影响部分PEDV编码蛋白的表达。5.PEDV nsp16泛素化修饰类型及泛素化修饰位点的确定由于超表达泛素对PEDV nsp16表达的影响最为显著,因此选择该蛋白进行了深入研究。首先通过Co-IP实验检测PEDV nsp16与泛素的相互作用,发现PEDV nsp16与野生型泛素及泛素突变体K6-Ub、K11-Ub、K29-Ub、K48-Ub、K63-Ub均存在相互作用,说明PEDV nsp16存在多种类型的泛素化修饰。为了确定PEDV nsp16具体的泛素化修饰位点,构建了PEDV nsp16的20个赖氨酸单点突变的真核表达质粒,将其分别与泛素的真核表达质粒共转染HEK-293T细胞,通过Co-IP实验检测发现,与野生型nsp16相比,K185R突变体的泛素化修饰水平明显降低,而K280R突变体的泛素化修饰水平显著升高,说明K185和K280为PEDV nsp16的重要泛素化修饰位点。6.PEDV nsp16的泛素化修饰有利于病毒增殖为了分析PEDV nsp16的泛素化修饰在病毒增殖过程中的作用,利用PEDV AJ1102株的感染性克隆,构建了nsp16 K185和K280分别突变的重组病毒r AJ1102-K185R和r AJ1102-K280R,并同步拯救了野生型病毒r AJ1102。通过增殖曲线检测发现,r AJ1102-K185R和r AJ1102-K280R与r AJ1102在Vero细胞上具有相似的增殖动力学,但r AJ1102-K185R的滴度明显低于r AJ1102,而r AJ1102-K280R的滴度显著高于r AJ1102,说明PEDV nsp16的泛素化修饰有利于病毒增殖。综上所述,本研究揭示了PEDV感染与细胞内蛋白泛素化修饰之间存在相互调控作用,证明了PEDV nsp16的泛素化修饰能够促进病毒增殖,加深了对PEDV感染细胞具体作用机制的认识。