随着人们饮食结构和生活方式的改变,我国高尿酸血症患病人数逐年增加,目前约为1.2亿人,高尿酸血症已成为危害我国人民身体健康的严重代谢疾病之一。临床常用的高尿酸血症治疗药物如别嘌呤醇(Allopurinol,Alp)、非布索坦和苯溴马隆均存在不同形式的毒副作用,而黄酮-金属配合物具有生物活性强、毒副作用低的优点。因此,开发安全高效的新型黄酮金属配合物降尿酸功能活性因子,对于保护人民身体健康具有重要意义。本文以橙皮素(Hesperitin,Hsp)为原料,制备了一种新型橙皮素-铜(Ⅱ)(Hsp-Cu(Ⅱ))配合物,并对其结构进行表征,测定了其毒性作用,研究了配合物在体外对尿酸合成关键酶——黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XO)活性的抑制作用,并采用分子模拟技术探讨了配合物抑制XO的机制。进一步建立了高尿酸血症小鼠模型,以Hsp和Alp为对照,探究了Hsp-Cu(Ⅱ)配合物在小鼠体内的降尿酸和肾保护作用及机制。论文的主要内容和结果如下:1.Hsp和铜离子能以2:1的比例在碱性条件下螯合生成Hsp-Cu(Ⅱ)配合物,产率约为79.21±8.73%。配合物中的Cu结合在Hsp的A环5号位羟基以及C环4号位羰基上,分子中存在两个结合水和一个游离水,其分子式为[Cu(Hsp)_2(H_2O)_2]·H_2O。小鼠的急性经口毒性试验显示Hsp-Cu(Ⅱ)配合物为实际无毒物质。2.Hsp-Cu(Ⅱ)配合物具有较强的体外抑制XO活性能力,其IC_(50)值为2.11×10~(Desiccation biology-6) mol L~(-1),比Hsp的IC_(50)值(2.38×10~(-5) mol L~(-1))低了一个数selleckchem量级。Hsp-Cu(Ⅱ)配合物在结合到XO的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)活性区域过程中形成的额外“金属受体键”可以使配合物中的Cu作为电子转移的桥梁,吸引黄嘌呤在氧化过程中转移的电子转移到配合物上,使底物O_2无法获得足够的电子形成O_2~-自由基,而Hsp只能占据XO的Mo-pt活性通道来阻止底物黄嘌呤与XO结合。Hsp-Cu(Ⅱ)配合物与XO的结合位点不同于Hsp,而且配合物中Cu在配合物与XO结合中发挥电子转移的桥梁作用,使得Hsp-Cu(Ⅱ)配合物抑制XO活性能力强于Hsp。3.制备的Hsp-Cu(Ⅱ)配合物的降尿酸能力显著提高,60 mg/kg剂量的配合物能使高尿酸血症小鼠的血清尿酸(Uric acid,UA)水平降低30.97%,降尿酸效果与阳性对照Alp相当,而相同剂量的Hsp只降低了16.01%的血清UA。60mg/kg剂量的Hsp-Cu(Ⅱ)配合物对高尿酸血症小鼠肝脏中XO和腺苷脱氨酶(ADA)活性的抑制率分别为38.42%和18.41%,较同剂量的Hsp有显著提高(XO:10.94%,ADA:3.74%)。此外,60 mg/kg剂量的Hsp-Cu(Ⅱ)配合物均能使肾脏中与尿酸重吸收相关的尿酸盐阴离子转运体1(URAT1)和葡萄糖转运体9(GLUT9)的m RNA和蛋白表达量下调,m RNA表达减少率分别为30.66%和38.75%,蛋白表达量减少率分别为43.04%和40.51%,同时使尿酸分泌相关的有机阴离子转运体1(OAT1)的m RNA表达上调42.22%,蛋白表达量增加58.13%。而同剂量的配体Hsp对个尿酸转运蛋白表达量的影响均弱于同剂量的配合物(URAT1:27.84%、GLUT9:30.38%、OAT1:23.25%)。Hsp-Cu(Ⅱ)配合物是以剂量依赖的方式,通AG-221浓度过减少肝脏中尿酸合成和增加肾脏中尿酸排泄来达到降尿酸效果。4.肾脏切片显示Hsp-Cu(Ⅱ)配合物对肾脏的组织损伤有较好的恢复效果,配合物能以剂量依赖的方式,使受损的肾脏组织基本恢复的正常状态,而Hsp组和Alp组的小鼠肾脏中,依然存在着大量的肾小球萎缩、肾小管水肿和炎性浸润的情况。此外,60 mg/kg剂量的Hsp-Cu(Ⅱ)配合物对肾小球的滤过功能损伤也有较好的恢复效果,肌酐(Creatinine,Cr)和尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)含量分别下降了15.81%和40.47%,而Hsp组中只分别下降了9.91%和26.49%。Hsp-Cu(Ⅱ)配合物的抗氧化应激能力要显著强于配体Hsp,60 mg/kg剂量的Hsp-Cu(Ⅱ)配合物能使超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)的活性分别提高72.96%和27.77%,而同剂量的Hsp只能分别提高2.47%和12.81%。Hsp-Cu(Ⅱ)配合物对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症通路的表达也有较强的抑制作用,NLRP3、ASC和Caspase-1三种蛋白的含量相较模型组分别减少了44.15%、29.95%和33.60%,效果显著强于同剂量的Hsp(23.02%、15.42%和20.10%)。NLRP3炎症通路表达的下调会减少白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、生长转化因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)等细胞因子的生成量以起到肾保护作用,60 mg/kg剂量的Hsp-Cu(Ⅱ)配合物对四种细胞因子生成的抑制率分别为30.07%、28.59%、36.17%和24.15%,效果要明显强于Hsp(16.47%、15.75%、26.99%和18.76%)。Hsp-Cu(Ⅱ)配合物的肾保护作用是通过降低肾脏氧化应激、下调NLRP3炎症通路表达,使细胞因子的生成减少来实现的。