【目的】棉花(Gossypium hirsutum L.)是世界上最重要的经济作物之一,是关系国计民生的重要战略物资。棉花在生产过程中常常受到各种生物胁迫,其中黄萎病严重影响棉花的产量和品质,被称为棉花的“癌症”。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的一种土传性维管束真菌病害。由于大丽轮枝菌其稳定存在的微菌核结构以及多变的生理小种,导致黄萎病至今难以防治。在作物病害防治方法中,抗病品种的选育是最经济有效的防治措施。RNAi干扰技术正越来越多地应用于作物保护以防御病原菌的危害。近年来,研究发现糖代谢对于病原菌的生长发育及致病性具有重要作用,但V.dahliae中相关研究报道仍较少。本研究对V.dahliae中的糖代谢相关基因Vd ST和Vd PT1进行鉴定和功能研究,为V.dahliae致病分子机制的解析提供理论依据,为利用RNAi技术培育棉花抗病新种质提供新靶标。【方法】从V.dahliae全基因组水平鉴定糖转运蛋白家族基因并进行生物信息学分析。设计靶向Vd ST3(asi R201和asi R1238)和Vd ST12(asi R815和mycobacteria pathologyasi R1436)的asi RNAs分别与V.dahliae共培养,对共培养V.dahliae的各项生理指标和致病力等进行调查;利用同源重组的方法构建中性海藻糖酶基因Vd PT1的敲除载体和回补载体,利用PEG-Ca Cl_2介导的遗传转化方法转化V.dahliae原生质体,获得缺失突变体菌株和回补突变体菌株,并对各菌株的生理指标和致病力等进行调查;利用TRV介导的HIGS沉默棉花中Vd ST3、Vd ST12和Vd PT1基因,调查V.dahliae侵染HIGS处理植株后的发病症状和病情指数,并利用q RT-PCR检测真菌生物量和基因表达水平;将V.dahliae致病基因Vd ST3、Vd ST12和Vd PT1作为靶标,利用RNAi技术创制棉花抗病新种质。【结果与结论】(1)从V.dahliae基因组数据库中共鉴定出65个糖转运蛋白基因(Vd ST1-Vd ST65),这些成员被划分到8个进化分支,每个分支对应特异的糖类底物。根据前期转录组数据分析发现9个Vd STs基因仅受感病棉花品种根系分泌物的诱导,选取Vd ST3和Vd ST12进行进一步功能研究。将靶向Vd ST3和Vd ST12的asi RNAs分别与Vd991进行共培养,q RT-PCR检测发现共培养后Vd991中Vd ST3和Vd ST12基因的表达量明显降低,菌落和菌丝生长受到明显抑制,其中靶向Vd ST12基因的asi RNAs抑制效果更显著。经靶向Vd ST12的asi RNAs(asi R815+确认细节asi R1436)处理后Vd991的致病力明显降低。研究结果表明,糖转运蛋白基因Vd ST3和Vd ST12在V.dahliae生长发育和致病过程中发挥重要作用,asi RNAs可用作快速筛选致病相关基因的有力工具。(2)Vd PT1基因属于糖苷水解酶GH37亚家族,含有中性海藻糖酶典型的结构域。与野生型Vd991相比,Vd PT1基因缺失突变体菌株中海藻糖酶活性降低、海藻糖含量增加,葡萄糖含量降低,表明该基因参与内源海藻糖的代谢。与野生型Vd991相比,Vd PT1基因缺失突变体产孢量和孢子萌发率下降、菌丝和菌落生长减慢、菌丝穿透力减弱、黑色素增多、致病力降低,表明该基因在大丽轮枝菌生长发育和致病过程中发挥重要作用。(3)RNA-Seq测序结果分析发现,野生型Vd991和缺失突变体ΔVd PT1-1间共有3130个差异表达基因,包括1480个上调基因和1650个下调基因selleck GNE-140。差异基因GO和KEGG分析发现,Vd PT1基因缺失引起水解酶活性、水解O-糖基化合物相关基因表达量显著降低,其中大多与细胞壁降解酶相关,这些基因的下调是导致缺失突变体菌株菌丝穿透力减弱,致病力降低的原因之一;Vd PT1基因缺失引起糖酵解、磷酸戊糖、乙醛酸循环、核酸和氨基酸合成途径相关基因下调表达,这些基因的下调是导致缺失突变体菌株孢子萌发率和产孢量下降,菌丝和菌落生长减慢的重要原因;Vd PT1基因缺失突变体中甘油磷脂代谢和类固醇代谢途径相关基因表达升高,这些基因的上调会引起细胞膜组分发生变化,导致缺失突变体菌株抗逆能力增强。上述基因的表达变化为解释野生型Vd991和Vd PT1基因缺失突变体菌株间的表型差异提供了分子证据。(4)利用HIGS沉默寄主中Vd ST3、Vd ST12或Vd PT1均有效减轻了病原菌对棉花的危害,增强了棉花的抗性,表明3个基因均可用作RNAi创制棉花抗病新种质的靶标。成功构建了Vd ST3、Vd ST12和Vd PT1基因的RNAi载体,用农杆菌介导的转化方法侵染棉花下胚轴,已获得T0代转基因植株,为棉花抗病育种提供了新种质。