伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种猪的病毒性神经性急性传染病,临床上主要表现为仔猪神经症状、大中猪呼吸道症状、怀孕母猪流产或产死胎和木乃伊胎等症状。接种疫苗是PR防治的主要方式,除了疫苗接种外,药物防治作为Pselleck NMRR防控的一种潜在策略具有一定的研究前景。目前尚无治疗PRV感染的特效药物,因此探寻抑制PRV感染的药物对于PR的治疗具有重要意义。1.含EGFP的重组PRV示踪病毒的构建本研究首先以PRV变异株JSY13为研究对象,利用细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)技术及无缝克隆技术将 PRV JSY13 毒株 UL23(TK)基因的左右两侧同源臂连于含EGFP的pBeloBAC11载体上,构建中间转移载体pBAC-FR-EGFP。将pBAC-FR-EGFP与PRV JSY13基因组共转染非洲绿猴肾细胞(Vero),使其在JSY13 UL23基因两端进行同源重组,以BAC-EGFP序列替换掉UL23基因,通过在显微镜下观察是否有绿色荧光,判断是否成功构建含EGFP的重组PRV。随后,通过病毒噬斑试验对重组PRV进行纯化,并对重组病毒的生长特性进行鉴定。结果显示,PRV JSY13毒株UL23基因的左右同源臂成功连于含EGFP的pBeloBAC11载体,成功构建了中间转移载体pBAC-FR-EGFP。利用磷酸钙转染法将pBAC-FR-EGFP与PRV JSY13基因组共转染Vero细胞,72小时后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光病毒,表明成功构购买Y-27632建了含EGFP的重组rJSY13-△TK-EGFP。利用噬斑试验对重组病毒进行纯化,最终纯化出重组病毒rJSY13-△TK-EGFP。病毒增殖曲线结果表明,构建的rJSY13-△TK-EGFP毒株增殖效率较亲本毒株出现一定程度的减弱。2.抗PRV药物的筛选及作用机制研究以构建的PRV rJSY13-△TK-EGFP作为示踪病毒,根据药物处理后病毒荧光强度的强弱,对240种天然化合物进行抗PRV药物的筛选。然后,利用CCK-8细胞活性试剂盒检测所筛选药物对细胞的毒性。同时,利用Cell-based-ELISA方法,检测药物抑制50%的病毒所需要的药物浓度(IC50)。随后,以不同浓度药物预处理PK15细胞并接种JSY13(0.15 MOI),通过蛋白质免疫印迹(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)进一步验证药物对PRV增殖的影响。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和病毒噬斑试验测定药物对PRV吸附、入胞、释放等不同复制阶段的影响。最后,在小鼠模型上,通过临床症状观察、解剖病变、病毒载量及存活数量,探讨药物对PRV体内增殖的影响。结果显示,蟾毒灵medical consumables(bufalin)、没食子儿茶素没食子酸酯(Gallocatechin gallate,GCG)和柴胡皂苷D(Saikosaponin D,SSD)三种药物处理后,PRV荧光强度明显减弱,表明三种药物可抑制PRV增殖。细胞毒性试验结果表明,bufalin和GCG的药物浓度达到120 μM和160 μM时,细胞活性仍旧在80%以上;SSD致死50%宿主细胞所需要的药物浓度(CC50)为14.430μM。Cell-based-ELISA结果显示,bufalin、GCG和SSD抑制 PRV 增殖的 IC50 分别为 0.033 μM、0.410 和 1.692 μM。Western blot及IFA结果显示随着bufalin、GCG和SSD药物浓度的增加,药物抑制PRV增殖的现象越明显。对三种药物影响PRV增殖阶段的探究表明,bufalin主要通过影响PRV的入胞阶段以抑制PRV增殖;GCG主要通过影响PRV入胞及释放阶段抑制PRV的增殖;SSD对PRV吸附、入胞和释放阶段均有明显的抑制作用。由于0.033μM的bufalin就可以抑制PRV,且bufalin浓度达到120 μM也不会对细胞产生毒性,这表明bufalin可能是一种比较安全有效的PRV抑制剂,所以我们选择了 bufalin进行了 PRV的体内增殖试验。体内试验结果表明,腹腔注射bufalin可推迟PRVJSY13引起的神经症状的出现时间;解剖结果显示bufalin可明显减轻小鼠各组织充血及出血现象;qRT-PCR结果显示,bufalin处理组中小鼠肝、脾、肺、脑等组织中PRV载量与PRV攻毒对照组相比均显著下降。记录小鼠死亡情况并绘制小鼠死亡曲线,发现bufalin可提高20%(2/10)小鼠生存率。综上所述,本研究发现bufalin、GCG和SSD三种药物可显著抑制PRV在PK15细胞中的复制;其中bufalin一定程度上也能够抑制PRV在BALB/c小鼠体内的复制,降低小鼠死亡率。本研究为PRV抗病毒药物的研究奠定了基础,同时为其他疱疹病毒的抗病毒药物研发提供参考借鉴。