研究背景与目的:口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是头颈癌中常见的恶性肿瘤,其发病率呈增长趋势。来源于植物或膳食材料的天然活性小分子化合物具有高效低毒的抗肿瘤活性,是抗肿瘤药物开发的重要来源。异莲心碱(Isoliensinine)是从睡莲属植物-莲中分离提取的一种双苄基异喹啉类生物碱,具有保护血管、抗心律失常、抗肿瘤等生物学活性。已发现Isoliensinine通过调节NF-κB、PI3K/AKT、JNK、p38等信号通路的激活抑制乳腺癌、宫颈癌、肝癌等肿瘤细胞的增殖。然而,目前还没有研究阐述Isoliensinine对OSCC的生物学作用,也没有关于ERK信号通路参与Isoliensinine抗肿瘤活性的报道。因此,本研究以OSCC细胞株HSC-3和HSC-4为研究对象,探讨Isoliensinine对OSCC细胞增殖的抑制作用,并阐述其激活p38和JNK信号通路、调控ERK信号通路发挥增殖抑制作用的分子机制。大多OSCC患者的五年生存率较低,这主要和OSCC患者对治疗药物的敏感性降低有关。肿瘤耐药的出现会大大降低现有药物的治疗效果。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类长度约为22nt的短链非编码RNA,能调控基因表达。一些危险刺激因素能诱导miRNA紊乱表达,而miRNA的紊乱表达被发现和肿瘤的发生及耐药密切相关。调控miRNA紊乱表达的治疗方法在肿瘤治疗领域展现出极佳的研究前景。研究发现,miR-7-5p在肿瘤中呈低表达状态。外源转染miR-7-5p模拟物能上调miR-7-5p在肿瘤细胞内的表达,抑制结直肠癌、肺癌等多种肿瘤细胞增殖,并能提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。临床上,OSCC的发生发展是复杂调控网络共同刺激的结果,利用单一化疗药物长期有效的抑制肿瘤细胞增殖还存在一定的限制。为预防肿瘤耐药发生、提高治疗效果,临床多采取联合用药策略。在第一章的实验结果即Isoliensinine能抑制OSCC细胞增殖的基础上,拟用Isoliensinine和miR-7-5p模拟物联合处理OSCC细胞株HSC-3,期望观察到Isoliensinine联合miR-7-5p对HSC-3细胞增殖的协同抑制作用,为天然产物联合miRNA协同抗OSCC的策略提供支持。材料与方法:第一章1.利用CCK-8法检测Isoliensinine对OSCC细胞株HSC-3和HSC-4增殖活力的影响;2.Isoliensinine作用后,利用RNA-seq技术分析HSC-3细胞基因在m RNA水平上的差异表达情况;3.利用PI、Annexin V-FITC/PI、JC-1、DCFH-DA荧光染料和流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)检测Isoliensinine对HSC-3细胞和HSC-4细胞周期比例、凋亡、线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential,MMP)和活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的影响;4.利用蛋白免疫印迹实验(Western Blotting,WB)检测Isoliensinine对OSCC细胞周期蛋白表达,VE-822线粒体途径和MAPK信号通路相关蛋白表达的影响。第二章1.Isoliensinine作用后,利用RNA-seq技术分析HSC-3细胞内miRNA的差异表达情况;2.利用定量PCR(Quantitative PCR,q PCR)检测外源转染miRNA模拟物后HSC-3细胞和HSC-4细胞内miRNA的表达情况,同时检测Isoliensinine对HSC-3细胞内miR-7-5p表达的影响;3.利用CCK-8法检测miR-7-5p模拟物单独处理对OSCC细胞株HSC-3和HSC-4增殖活力的影响,同时检测Isoliensinine和mSediment ecotoxicologyiR-7-5p模拟物联合处理对HSC-3细胞增殖活力的影响;4.利用OMIM、Gene Cards和Disgent数据库获取OSCC靶点信息,miRWalk和Target Scan8.0数据库筛选miR-7-5p的作用靶点。对OSCC靶点和miR-7-5p作用靶点取交集,获得“miR-7-5p-OSCC”共同靶点。利用STING数据库分析“miR-7-5p-OSCC”共同靶点的相互作用网络,并利用Cytoscape3.9.0软件进行可视化分析和核心靶点筛选。利用DAVID数据库对“miR-7-5p-OSCC”共同靶点进行GO和KEGG分析;5.用DCFH-DA、JC-1、Annexin V-FITC/PI荧光染料和FCM检测Isoliensinine联合miR-7-5p模拟物处理对HSC-3细胞ROS水平、MMP和凋亡的影响。结果:第一章1.CCK-8检测结果显示Isoliensinine以时间依赖和药物浓度依赖的方式抑制OSCC细胞株HSC-3、HSC-4增殖;Isoliensinine作用24 H、48 H后,对HSC-3细胞的IC_(50)分别为39.50μM、21.10μM;对HSC-4细胞的IC_(50)分别为57.28μM、43.31μM;2.RNA-seq分析发现Isoliensinine处理后,HSC-3细胞内1831个已知基因有显著的表达差异,其中表达上调的有1202个,表达下调的有629个;对差异表达基因进行GO分析和KEGG分析,结果显示Isoliensinine可能调控MAPK、p53、PI3K/AKT等信号通路的活化和肿瘤相关miRNA表达;3.Isoliensinine作用HSC-3细胞和HSC-4细胞后,FCM检测结果显示Isoliensinine诱导周期阻滞在G2/M期、细胞凋亡、MMP降低和ROS水平增加;4.WB结果显示Isoliensinine能增加HSC-3细胞和HSC-4细胞p-cdc25c、p-cdc2、Bax、Bid、cleaved caspase-3/-9、cleaved PARP、p-p38和p-SPAK/JNK的表达,降低p-ERK1/2的表达。第二章1.RNA-seq分析结果显示Isoliensinine处理后,HSC-3细胞内52个已知和未知miRNA有显著的表达差异,其中表达上调的有18个,表达下调的有34个;对差异表达miRNA的靶基因进行GO和KEGG分析,分析结果显示差异表达mselleckiRNA的靶基因可能和趋化因子、炎症介质、MAPK信号通路相关。2.qPCR结果显示Isoliensinine对HSC-3细胞内miR-7-5p表达的影响不具有统计学意义;外源转染miR-7-5p模拟物能显著增加miR-7-5p在HSC-3细胞和HSC-4细胞内的表达水平;3.CCK-8检测结果显示,miR-7-5p高表达能抑制HSC-3细胞和HSC-4细胞增殖;进一步研究发现Isoliensinine和miR-7-5p模拟物联合处理对HSC-3细胞的增殖具有协同抑制效果;4.从数据库获得928个OSCC靶点,1669个miR-7-5p靶点。取交集获得70个“miR-7-5p-OSCC”共同靶点。Cytoscape3.9.0软件分析结果显示“miR-7-5p-OSCC”的核心靶点包括EGFR、BRCA1、PIK3CA、EGF和NF1等。GO分析和KEGG分析结果显示“miR-7-5p-OSCC”共同靶点参与调节DNA损伤等生物学功能,调控药物抵抗、Fox O、Erb B、HIF-1等信号通路。5.FCM结果显示Isoliensinine和miR-7-5p模拟物联合处理能显著增加HSC-3细胞ROS水平、降低MMP和诱导细胞凋亡。结论:1.Isoliensinine对OSCC细胞株HSC-3和HSC-4的增殖具有抑制作用,其潜在的分子机制可能是Isoliensinine通过ROS介导的MAPK信号通路和线粒体途径阻滞OSCC细胞周期在G2/M期并诱导细胞凋亡。2.Isoliensinin诱导OSCC细胞HSC-3内52个miRNA差异表达;Isoliensinine对HSC-3细胞内miR-7-5p表达的影响不具有统计学意义;Isoliensinine联合miR-7-5p模拟物对HSC-3细胞的增殖具有协同抑制效果,其可能的分子机制与ROS介导的细胞凋亡相关。