SEP4(SEPALLATA4)基因属于MADS-box基因家族,作为花发育的ABCDE的E类基因之一,它在植物中的分生组织的确定性、花器官分化以及花期调控具有重要的作用。大豆[Glycine max(L.)Merr.]属蝶形花亚科,是我国重要的粮食作物之一,含有丰富的蛋白质等营养成分,对人类具有重要的营养价值。为研究大豆SEP4基因的生物学功能,本研究在大豆基因组范围内鉴定得到4个与At SEP4同源的基因,通过系统发育、基因结构、共线性、蛋白质二级与三级结构预测、启动子顺式元件预测等生物信息学分析,明确了Gm SEP4s基因的基本属性。利用q RT-PCR对大豆W82的不同发育阶段的花器官表达模式进行分析,还通过构建过表达及CRISPR/Cas 9基因编辑载体分别转化拟南芥和大豆,通过对异源、同源表达转基因阳性植株生物学功能分析,进一步探究大豆Gm SEP4s基因的功能。主要研究结果如下:1.大豆中共有4个At SEP4的同源基因,分别命名为Gm SEP4a、Gm SEP4b、Gm SEP4c和GABT-263溶解度m SEP4d,都含有保守的MEF2-like MADS-domain和K-domain。Gm SEP4s与At SEP4亲缘关系较近聚类在一支,Gm SEP4a和Gm SEP4b、Gm SEP4c和Gm SEP4d分别聚类在同一支,Gm SEP4s与单子叶的SEP类蛋白亲缘关系相对较远。Gm SEP4a和Gm SEP4b可能源于At SEP4,Gm SEP4c和Gm SEP4d可能源于大豆染色体复制。它们的启动子具有多种光响应元件、激素响应元件和转录因子结合位点等。这四个基因主要在花中表达,此外Gm SEP4a、Gm SEP4b和Gm SEP4c还在种子中表达,推测Gm SEP4a/b/c可能除了与大豆花器官特化相关还和种子发育相关。2.Gm SEP4a和Gm SEP4b、Gm SEP4c和Gm SEP4d表达模式相似。Gm SEP4a/b基因在开花早期、将授chemical disinfection粉时期、已授粉时期主要在花萼和雄蕊中进行表达;在开放期的花瓣和雄蕊中高表达。Gm SEP4c/d除了已授粉时期的雄蕊,它在不同时期的花萼、雄蕊均有高表达。推测这四个基因在花发育的前三个时期可能在花萼与雄蕊中发挥作用,在花开放期时可能在花瓣和雄蕊中发挥作用。3.Gm SEP4a、Gm SEP4b、Gm SEP4c和Gm SEP4d蛋白均定位于细胞核中。p Gm SEP4a:GUS转基因植株的根、茎、叶、果荚、花序都能被染色,SEP4a基因启动子驱动GUS基因在整株拟南芥中都有较高表达;p Gm SEP4b:GUS转基因植株的果荚、花序都能被染色,Gm SEP4b基因启动子驱动GUS基因在拟南芥的花序中有较高表达、果荚中的表达较低。4.Gm SEP4b蛋白具有自激活能力,Gm SEP4a/c/d蛋白都不具有自激活能力。Gm SEP4a/c/d蛋白都能够与自身蛋白互作,且相互之间也能互作。Gm SEP4蛋白都能与Gm AP1s等MADS蛋白互作。Gm SEP4a/b蛋白都能够与Gm FUL1a/b、Gm FUL3a/b蛋白互作,Gm SEP4b蛋白还能够与Gm FUL2b蛋白互作;Gm SEP4c/d蛋白都不能与Gm FULs蛋白互作。5.成功构建Gm SEP4s基因的过量表达载体,分别转化拟南芥和大豆。p35S:Gm SEP4a-3Flag、p35S:Gm SEP4b-3Flag转基因拟南芥植株都出现了早花现象;p35S:Gm SEP4d-3Flag转基因拟南芥植株的花期无明显变化。在大豆中,过量表达SEP4a基因可观察到长、短日照条件下的转基因植株出现早花现象,过量表达SEP4b基因的转基因植株在长、短日照条件下并未观察到花期发生变化。Gm SEP4a、Gm SEP4b、Gm SEP4d的转基因拟南芥和Gm SEP4a、Gm SEP4b的转基因大豆的花器官形态均无明显变化。6.成功构建Gm SEP4-1-Cas9和Gm SEP4-2-Cas9两个基因敲除载体,Gm SEP4-1-Cas9的T3、T4靶点能被有效编辑,Gm SEP4-2-Cas 9的T6、T7、T8靶点能被有效编辑。并通过遗传转化大豆获得了sep4c、sep4d、sep4c sep4d T_2代突变体,sep4a、sep4b的突变体还需继续筛选。在短日照条件下,sep4c、sep4d和sep4c sep4d突变体的花萼和花瓣均发生形态变化,但他们的花期无明显变化。目前已鉴定得到4个大豆SEP4基因,对其进行生信分析和功能研究发现Gm SEP4https://www.selleck.cn/products/ch-223191.htmla基因参与大豆开花期的调控,Gm SEP4c、Gm SEP4d基因参与大豆花器官的调控,至于Gm SEP4b在花器官发育方面的作用还有待进一步研究。