背景在辅助生殖过程中,成功进行体外受精(In vitro fertilization,IVF)的成熟卵母细胞在体外培养过程中,分裂至2～8细胞阶段时分裂停止不再继续发育形成可移植囊胚的现象称为早期胚胎发育阻滞(Early embryonic arrest,EEA),该现象给人类辅助生殖技术带来巨大挑战。环境因素是目前已知的对生殖发育具有重要影响作用的因素之一,因此,从环境因素视角深入探索EEA的风险因素,以提高不孕症患者的胚胎质量,具有重要科学意义。目的本研究基于病例对照研究,分析进行IVF周期的不孕症妇女外周血中砷(Arsenic,As)、汞(Mercury,Hg)、铅(Lead,Pb)、钡(Barium,Ba)联合暴露水平与EEA风险之间的关联,并筛选哪种或哪些金属元素在此关联中发挥主导作用;探索与EEA风险关联具有显著统计学意义的线粒体DNA非编码区(Mitochondrial DNA displacement loop,mt DNA D-loop)的基因多态性位点,并分析其与EEA风险的关联强度;评估筛选出的mt DNA基因位点多态性在不孕症妇女有害金属元素暴露与EEA风险关联之间是否存在中介效应;评估筛选出的mt DNA基因位点多态性与有害金属元素暴露之间是否存在交互作用。方法本研究采用非匹配病例对照研究设计,研究对象均为2017年6月～2020年3月就诊于安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心的不孕症妇女:以IVF新鲜周期(取卵周期)发生EEA的不孕症妇女作为病例,共纳入74人(123个IVF新鲜周期);以IVF新鲜周期(取卵周期)优质囊胚率≥70%的不孕症妇女作为对照,共纳入157人(180个IVF新鲜周期);纳入时确保两组不孕症妇女年龄与体重指数的差异无显著统计学意义。研究对象的人口统计学特征和临床信息均从该生殖医学中心病案系统收集。采用电感耦合等离子体质谱仪测定两组不孕症妇女首次进入临床新鲜周期时取卵当日采集的外周血中As、Hg、Pb与Ba四种金属元素的暴露水平;使用聚合酶链式反应扩增与测序检测mt DNA D-loop区基因多态性位点。采用贝叶斯核回归方程(Bayesian kernel machine regression,BKMR)分析四种金属元素联合暴露水平与EEA风险之间的关联,并筛选哪种或哪些金属元素在此关联中发挥主导作用;采用广义估计方程模型(Generalized estimating equation,GEE)分析筛选出的金属元素暴露水平与EEA风险及卵子发生和胚胎发育进程相关指标的关联强度;采用χ~2检验筛选与EEA风险关联具有显著统计学意义的mt DNA D-loop区基因多态性位点,并采用GEE模型分析这些mt DNA基因位点多态性与EEA风险的关联强度;采用中介效应模型评估筛选出的mt DNA基因位点多态性在不孕症妇女有害金LBH589配制属元素暴露与EEA风险关联之间是否存在中介效应;采用GEE模型分析筛选出有害金属元素暴露与mt DNA基因多态性位点的交互作用与EEA风险的关联强度并采用Andersson等人编制的Excel计算器计算相加交互作用的超额相对危险度(Relative excess risk due to interaction,RERI),相加交互作用的比例(Attributable proportion due to interaction,AP)和交互作用指数(Synergy index,S)的估计值及其95%置信区间(Confidence interval,CI)。结果病例组不孕症妇女外周血中As、Hg、Pb和Ba浓度的几何均数(Geometric mean,GM)分别为1.35μg/L、1.51μg/L、23.45μg/L、34.15μg/L,其中病例组不孕症妇女外周血Ba浓度明显高于对照组不孕症妇女(P=0.009)。BKMR结果显示,Ba和Hg与EEA风险呈正相关,As和Pb与EEA风险呈负相关;As、Hg、Pb和Ba的后验概率(Posterior inclusion probabilities,PIP)分别为0.5902、0.6374、0.5548、0.9322,其中Ba的PIP值最高,故Ba可能在四种金属元素联合暴露中发挥主导作用。进一步分析金属元素Ba与EEA风险的关联,与Ba低暴露水平组(<13.36mg/L)不孕症妇女相比,中暴露组(13.36～46.29μg/L)和高暴露组(≥46.29mg/L)不孕症妇女EEA风险显著增加,调整协变量后的比值比(Odds ratio,ORs)及其95%置信区间(Confidence interval,CI)分别为2.61(1.27,5.36)和3.88(1.68,8.95)(P trend=0.005);进一步分析Ba暴露水平与不孕症妇女卵子发生和胚胎发育进程相关指标的关联时,我们发现在调整协变量前后,Ba暴露水平与上述指标均呈负相关,关联均具有显著统计学意义。在检测出的268个mt DNA D-loop区基因多态性位点中,在两组不孕症妇女中,突变频率>10%的位点有27个,采用c~2检验分析突变频率>10%的mt DNA基因位点多态性在两组不孕症妇女中的分布差异并对其所得P值进行错误发现率(False discovery rate,FDR)校正,仅发现mt DNA 16519这一基因位点的多态性(T16519T vs.T16519C)在两组不孕症妇女间的分布差异具有显著统计学意义(P_(FDR)=0.027)。与携带野生型mt DNA 16519基因(T16519T)的不孕症妇女相比,携带突变型mt DNA 16519基因(T16519C)的不孕症妇女EEA风险显著增加(OR(95%CI):3.30(1.58,6.79))。进行一系列敏感性分析后,上述分析结果依旧稳健。中介效应模型分析结果显示,在本研究人群中,调Fer-1体外整协变chemical pathology量后,mt DNA 16519基因多态性在不孕症妇女外周血Ba暴露水平与EEA风险之间的关联中无中介效应(间接效应估计值和95%CI为0.002(0.000,0.017)。交互作用结果显示,与Ba低暴露水平且携带野生型16519基因(Ba≤21.74mg/L&T16519T)的不孕症妇女相比,Ba高暴露水平且携带突变型16519基因(Ba>21.74mg/L&T16519C)不孕症妇女EEA风险的调整OR(95%CI)为8.83(2.93,26.65)(P<0.001),提示二者有相乘交互作用;同时mt DNA 16519基因多态性位点与Ba暴露的相加交互作用相关指标REPI、AP、S的估计值及其95%CI分别为4.07(-2.70,10.84)、0.46(-0.02,0.95)、2.08(0.68,6.37),结果提示二者无相加交互作用。结论本研究发现不孕症妇女外周血中As、Hg、Pb和Ba四种金属元素联合暴露与不孕症妇女EEA风险呈正相关,且Ba元素在联合暴露中可能发挥主导作用;Ba暴露水平与卵子发生和胚胎发育进程相关指标均存在显著的负向关联。与携带野生型mt DNA 16519基因(T16519T)的不孕症妇女相比,携带突变型mt DNA16519基因(T16519C)的不孕症妇女EEA风险显著增加,但调整协变量后,mt DNA 16519基因多态性在不孕症妇女Ba暴露与EEA风险关联之间在本研究人群中未发现中介效应;在上述关联中,Ba暴露水平与mt DNA 16519基因多态性间存在相乘交互作用,无相加交互作用。