邻苯二酚类污染物是石油化工产业中,主要的污染类副产物。由于其高致癌、难降解、强稳定等特性,被列为高毒化合物从而成为人们研究修复的重点。外二醇双加氧酶(EDOs)是邻苯二酚类污染物代谢通路中的关键酶,其可通过催化双羟基邻位C-C键的断裂使苯环开链降解,从而完成芳香环的脱毒过程。与其他的外二醇双加氧酶相比,Bph C家族酶有着更大的催化口袋及更广泛的底物谱,能够催化降解较大体积的天然底物2,3-二羟基联苯,同Pevonedistat生产商时对其他邻苯二酚单环衍生物展现出良好的催化活性。在治理环境污染方面有着更广阔的应用范围。因此基于Bph C家族双加氧酶的原有结构,对其进行改造,提高其催更多化活力以及进一步拓宽其底物谱具有重要的研究价值。经过前期研究,我们发现来自污染水体宏基因组中的Bph C-SD3对2,3-二羟基联苯有着极高的催water disinfection化活性,且能够催化降解邻苯二酚类部分单环底物,但对其活力较低,且对邻苯二酚4位取代底物无活。为了提高其对单环底物的催化活性、拓宽酶底物谱,本文基于Bph C-SD3的晶体结构进行酶与底物的分子对接,并通过半理性设计对其催化口袋内的潜在热点进行定点突变,获得到了性能突出的优势突变体。通过后续的酶学性质表征及位点与底物的作用方式分析,得出了该位点的改造机制。最后利用同家族酶Si0380进行突变位点普适性研究,验证了该位点在Bph C双加氧酶家族中的作用。具体研究内容与结果如下:1.基于Bph C-SD3与不同底物的分子对接结果及氨基酸序列保守度分析,对活性口袋内的非保守位点进行计算机模拟丙氨酸扫描。根据各底物的结合自由能评估结果,筛选得到具有综合改造潜力的关键位点His204。2.针对His204位点进行计算机模拟饱和突变,初步筛选得到具有理论上活力优势的第一批突变体。通过突变体构建、粗酶活力筛选及底物特异性测定,进一步筛选得到了活力优势显著、且底物适应性改变的突变体H204G、H204W及H204K。通过酶学性质表征发现,相较于野生型,突变体H204G对底物谱中现有底物的催化效率提高了2.8-8.7倍,突变体H204W提高了1.9-3.0倍,H204K对现有底物活力与野生型相近。但是,H204W及H204K对邻苯二酚4位取代底物展现出了野生型不具备的催化活力。通过进一步表征及复合物口袋催化结构分析结果发现,催化口袋的空间以及位点对底物作用力的转变影响着酶的催化效率,同时,酶的酸碱性偏好对底物适应性有着重要作用。3.通过与同家族Si0380的结构叠加比对分析,得到His204位点对应在Si0380上的同位点Asn218,并据此探究His204位点的改造在同家族酶中的普适性价值。通过对其位点的半理性设计以及酶学表征发现,由于Si0380较小的活性口袋,使得该位点对酶口袋空间的维持有重要作用,导致该位点在影响酶催化活力的同时,也影响着活性中心二价铁的结合。4.在探究口袋内非保守位点对Si0380二价铁的复位影响实验中发现,位于酶催化通道入口处的L298位残基的侧链缩小改造,提高了酶与底物亲和力,从而提高了酶对底物的催化效率。此结果证明了酶入口通道的扩宽,对酶对底物亲和力的提升有重要影响。综上,本研究经过理性设计筛选到了Bph C-SD3口袋内的优势位点,并构建得到了高催化活性及底物谱拓宽的突变体,提高了酶在生物降解芳香污染物方面的应用价值。