研究背景:感染性骨缺损一直以来都是骨科医生较难解决的临床问题,缺损部位的严重感染会导致血液供应受限,严重阻碍骨再生进程,破坏成骨微环境。目前的临床治疗标准包括控制感染和骨再生。只有控制好感染,才能进一步修复局部骨缺损。感染的临床治疗包括对局部感染部位进行清创,然后全身应用抗生素。然而,为了避免骨不连和肢体功能障碍的发生,进行彻底清创术的同时保留正常的骨组织对于外科治疗是有极大挑战的。而且由于感染局部细菌生物膜的形成,往往会导致抗生素不能够以足量的浓度从血液扩散到感染部位,导致不能彻底根除病原菌。同时,自体骨移植虽然被认为是促进骨修复临床治疗的金标准,但仍面临供体来源不足、并发症多的问题。同种异体骨移植物也因为经常出现免疫排斥和再感染等并发症而受到限制。在感染的骨缺损局部,种植体和细胞外基质为细菌提供了定植位点。如果细菌先定植,会严重阻碍骨再生的进程。相反,如果成骨细胞首先附着于种植体表面,随后成熟并分化,则可抑制细菌定植,从而促进骨修复。因此,构建一种既能抗菌又能促进骨再生的功能性生Alisertib供应商物材料,对于感染性骨缺损的治疗具有重要的临床意义。研究目的:壳聚糖(Chitosan,CS)是一种天然阳离子聚合物,带正电的壳聚糖分子可通过与细胞表面带负电荷的细菌分子直接接触而改变细胞通透性从而发挥抗菌作用。同时壳聚糖还具有良好的生物相容性、生物降解性,是目前骨组织工程中常用的生物材料之一。羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(Hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan,HACC)是通过在壳聚糖的游离羟基或氨基上引入季铵基团而制备的一种季铵化壳聚糖(Quaternized chitosan,QCS)。改性后,季铵化壳聚糖具有比壳聚糖更优秀的水溶性,因此在生理条件下的抗菌性能显著提升。虽然随着季铵化壳聚糖取代度的升高,能够获得相应的高抗菌性,但是同时也会伴随着明显的细胞毒性,不利于成骨细胞在局部的黏附增殖和分化。因此,本研究将壳聚糖和季铵化壳聚糖以不同的比例混合并制备成温敏性水凝胶从而在保留季铵化壳聚糖的高抗菌性的同时降低其细胞毒性,并将纳米羟基磷灰石(Nanohydroxyapatite,n HA),一种类似骨组织矿物质的生物材料Pathologic staging混合进一步提高水凝胶的骨整合能力从而构建了一种具有抗菌促成骨双重功能的生物活性界面,改善感染性骨缺损局部的微环境。研究方法:1.在4℃下,将2 w/v%不同比例的壳聚糖和季铵化壳聚糖混合溶液(85%/15%,90%/10%)与β甘油磷酸盐(β-glycerophosphate,β-GP)以一定的比例混合获得温敏性水凝胶,随后加入n HA,获得复合体系。2.通过扫描电镜观察水凝胶的表面形态,傅PF-07321332使用方法里叶红外光谱确定水凝胶的各成分吸收峰,通过流动变形实验检测水凝胶的弹性模量。3.体外研究分为5组进行:空白对照组(Control,CON)、壳聚糖/纳米羟基磷灰石水凝胶组(Chitosan/nano-hydroxyapatite hydrogel,C/H)、壳聚糖85%和季铵化壳聚糖15%/纳米羟基磷灰石水凝胶组(Chitosan85%-quaternized chitosan15%/nano-hydroxyapatite hydrogel,C85-Q15/H)、壳聚糖90%和季铵化壳聚糖10%/纳米羟基磷灰石水凝胶组(Chitosan90%-quaternized chitosan10%/nano-hydroxyapatite hydrogel,C90-Q10/H)和季铵化壳聚糖/纳米羟基磷灰石水凝胶组(Quaternized chitosan/nano-hydroxyapatite hydrogel,Q/H)。通过将各组水凝胶与小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(Mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1)共培养后进行细胞计数实验和活细胞/死细胞染色实验验证水凝胶的生物相容性;通过茜素红染色,碱性磷酸酶染色以及定量分析和实时定量聚合酶链反应验证复合体系对MC3T3-E1成骨分化的相关基因表达的影响。将水凝胶与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共培养后,通过活细菌/死细菌染色和平板涂布比较各组水凝胶的抗菌性能以确立壳聚糖和季铵化壳聚糖的最佳比例。4.体内研究建立新西兰大耳白兔感染性桡骨缺损模型,分为三组:空白对照组(Control,CON)和填充C/H及C85-Q15/H组。其中C85-Q15/H为阳性对照组。将各组水凝胶植入兔子感染性桡骨缺损中,通过X线,Micro-CT,组织学染色分析研究该比例下的水凝胶对感染状态下成骨微环境的影响。研究结果:1.本研究成功制备基于壳聚糖的温敏性水凝胶复合体系,扫描电镜结果显示纯壳聚糖水凝胶和壳聚糖-季铵化壳聚糖混合水凝胶的孔径大小约为300μm,并且不同混合比例对孔径大小没有影响。流变检测结果提示该水凝胶具有较好的弹性模量,能够维持一定的机械强度。2.细胞体外实验中,虽然季铵化壳聚糖水凝胶组具有较好的体外抗菌能力,但是该水凝胶细胞毒性较高,而其他组水凝胶均显示了良好的生物相容性和一定的抗菌能力。因此在体外成骨验证实验中,舍弃了Q/H组。C/H,C90-Q10/H,C85-Q15/H组水凝胶均促进了MC3T3-E1的成骨分化,上调了成骨相关基因的表达,并且C85-Q15/H组效果最佳。3.体内实验中,我们成功建立了新西兰大耳白兔感染性桡骨缺损模型,在各组水凝胶注射入桡骨骨缺损8周和12周后的X线,Micro-CT检测以及组织学染色结果中显示,相比较于CON组,C/H和C85-Q15/H组均促进了缺损处的骨再生,并且C85-Q15/H组优于C/H组。吉姆萨染色等体内抗菌实验也证实了C85-Q15/H组的体内抗菌性最佳。研究结论:本研究在壳聚糖水凝胶的基础上,合成了结合n HA的壳聚糖-季铵化壳聚糖温敏水凝胶。与纯壳聚糖水凝胶相比,这种共混水凝胶不仅保留了季铵化壳聚糖在高取代度下的抗菌性能,而且对细胞的毒性作用也大大减弱。该复合水凝胶可以上调成骨基因如RUNX2,OCN等的表达,促进感染微环境下骨再生。