氟苯尼考(Florfenicol,FF)作为广泛使用的兽用专用抗生素,由于水中难溶,目前相关研究多关注其增溶方法和在不同动物体内的药代动力学及组织分布特性。研究表明,氟苯尼考口服吸收良好,但目前关于口服氟苯尼考肠道吸收机制研究相对较少。寡肽转运蛋白1(Oligopeptide transporter 1,PepT1)是肠道粘膜中与肽类物质转运密切相关的转运体,FF结构中具有类似肽键的结构,本课题对FF肠道吸收过程中与PepT1之间的相互作用进行了研究,旨在探究FF基于PepT1的肠道转运机制;本研究从细胞水平进一步验证FF与PepT1之间的关系,并以PepT1作为靶点,通过细胞水平及分子水平两方面筛选能促进PepT1表达的口服吸收促进剂,以此增加FF在肠道中的摄取量。1、FF跨Caco-2细胞单层膜吸收的方向性采用Caco-2细胞模型进行FF的跨膜转运实验,以跨膜电阻值及两侧碱性磷酸酶的比值来验证细胞单层模型的成功建立。在Transwell板培养21 d后,各孔跨膜电阻均大于300Ω/cm~2,AP侧与BL侧的碱性磷酸酶活性比值接近3∶1,验证了细胞的紧密连接良好,细胞产生极化分化,形成了完整的细胞单层,可以用于转运实验。转运试验中,AP-BL侧的Ka值大于BL-AP侧的Ka值,存在显著性差异(P<0.05),即肠上皮面向肠腔侧存在转运蛋白使AP-BL侧的FF转运量增加。采用不同浓度FF进行细胞摄取后,当浓度<200μg/m L时,FF的摄取量随着浓度的升高缓慢增加,未见显著性差异(P>0.05),当浓度继续增加到200μg/m L时,其摄取量急剧增加,与低浓度存在明显的差异(P<0.05),而当浓度继续增加到>200μg/m L后,其摄取量并未随浓度的增加而显著性变化,则在低浓度时限制FF摄取的因素是FF的浓度,即此时在Caco-2中转运蛋白的量远大于FF分子,当浓度增加到一定范围后,限制FF摄取的是Caco-2中的转运蛋白量,即此时转运蛋白已达饱和,即FF在肠道中的转运不仅只是被动扩散。2、影响FF摄取的因素利用Caco-2细胞在支持物表面构建致密肠上皮单层模型,以2 h的FF细胞摄取百分率为指标,考察分子内酰胺键、不同SCH727965研究购买浓度Gly-Sar及维拉帕米对FF细胞摄取的影响。FF的代谢产物氟苯尼考胺(FFA)其分子结构式中不存在分子内酰胺键,低浓度(25-100μg/m L)FFA在Caco-2细胞中的摄取量随着浓度的升高而增加,此时影响FFA摄取的因素是FFA的浓度,不同浓度下FFA在Caco-2细胞中的摄取量明显低于FF,即可以说明FF在肠道中的转运明显优于FFA,分子内酰胺键对FF在肠道中的转运起到了推动作用。当添加Gly-Sar与FF进行共孵育后,无Gly-Sar共竞争组的摄取量明显高于添加Gly-Sar组,添加Gly-Sar后使FF的摄取量明显下降,两者存在显著性差异(P<0.05),且高浓度Gly-Sar组与低浓度Gly-Sar组间存在显著性差异(P<0.05),说明较高浓度的Gly-Sar共竞争PepT1位点较低浓度多,使得FF与PepT1接触的频率降低,摄取量减少。添加维拉帕米之后,FF在肠道的摄取量呈现明显的上升趋势,同时高浓度的维拉帕米促进作用更明显,P-gp对FF在肠道的吸收有明显的外排作用,即,P-gp参与了FF在肠道中的转运。3、FF口服吸收Stress biomarkers促进剂的筛选利用Caco-2细胞在支持物表面构建致密肠上皮单层模型,以2 h的FF细胞摄取百分率为指标,筛选不同吸收促进剂对FF摄取的影响,结果显示所筛选吸收促进剂均能显著性增加FF的摄取,且不同浓度的促进剂组间并未显著性差异(P>0.05),说明低浓度(25μg/m L)的促进剂便能影响FF的摄取。荧光定量结果显示CS、CMS-Na、EDTA-2Na、PEG6000及β-CD均能使PepT1上调,其中,只有CMS-Na和β-CD下调P-gp,PepT1为FF进入肠道侧的蛋白,上调PepT1后能显著性增加FF的摄取,P-gp为外排蛋白,下调P-Z-VAD-FMKgp的表达能使FF的外排减少,从而使FF进入体内的量增加,因此,筛选能够上调PepT1同时又能下调P-gp的辅料更能提高FF的摄取量,根据荧光定量PCR和Western-blot试验结果,CMS-Na和β-CD上调PepT1表达的同时使P-gp的表达下降,CMS-Na和β-CD可作为FF的口服吸收促进剂进行后续药动学实验。4、FF与口服吸收促进剂的在体吸收特性考察采用大鼠在体肠灌流考察FF与口服吸收促进剂对其跨肠道吸收的影响,将试验动物分为原药组(FF)与不同口服吸收促进剂组(CMS-Na和β-CD)共灌流组,总计3组,分别进行大鼠在体肠循环灌流2 h,每15 min测定循环液中FF浓度及酚红浓度。以酚红浓度的变化矫正循环液体积的变化,求得矫正体积后的FF浓度。不同促进剂组灌流后,吸收促进剂组与原药组的Peff存在显著性差异(P<0.05),说明吸收促进剂能明显增加FF在肠道中的摄取。5、FF与口服吸收促进剂的口服药代动力学研究将不同吸收促进剂组进行口服灌胃给药,给药后12 h内不同时间点通过眼眶后静脉丛采集静脉血,高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法测定血中FF浓度用于药动学分析。结果表明口服给予原药组、CMS-Na组、β-CD组后药动学数据符合二室模型,原药组、CMS-Na及β-CD三组的T1/2Ka存在显著性差异,吸收促进剂组<原药组,说明吸收促进剂促进了FF的口服吸收,CMS-Na的促进效果大于β-CD,AUC0-12与AUC0-∞也表现出同样的规律,即吸收促进剂增加了FF的口服吸收。本研究结果表明FF的肠道吸收与肠上皮转运蛋白PepT1存在相互作用关系,通过筛选口服吸收促进剂来增加FF在肠道中的摄取,结果显示所筛选的CMS-Na及β-CD能显著增加FF在肠上皮的摄取,上调PepT1的表达及增加FF在大鼠体内的吸收。