目的:癫痫是一种常见且具有致残性的中枢神经系统疾病。近年的研究显示,癫痫患者及癫痫动物模型中存在与铁死亡相关的血清、病理及影像学改变。铁死亡是以活性氧和铁超载引起严重脂质过氧化为特征的程序性细胞死亡方式,抑制铁死亡能够在癫痫动物模型中发挥神经保护作用。本研究初步探讨癫痫患者中的与铁死亡相关的潜在关键基因并进行验证,然后在慢性颞叶癫痫动物模型中初步探索经典的铁死亡抑制剂铁抑素-1(Ferrostatin-1,Fer-1)对其的作用。方法:1.通过生物信息学分析,本研究从基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中下载癫痫数据集GSE143272,从中筛选癫痫相关的差异表达基因;同时从铁死亡数据库中下载铁死亡驱动因子、抑制因子、标记因子文件并整理。将二者取交集,得到癫痫疾病中与铁死亡相关的差异表达基因,在对这些基因进行富集分析、蛋白质互作网络分析后,确定前10个候选的潜在铁死亡关键基因。本研究进一步在癫痫数据集GSE186334中对这10个基因进行验证,得到感兴趣的潜在铁死亡关键基因以进行临床和动物实验验证。2.为分别了解癫痫患者局部脑组织和外周血中潜在的铁死亡关键基因的表达水平,临床研究将研究对象分为2个部分进行探讨。A部分:收集经外科手术治疗的癫痫患者(癫痫组A,即SE-A组)及海绵状血管瘤患者(对照组A,即Ctrl-A组)的基本信息、脑组织切片(SE-A组选择病变组织,Ctrl-A组选择瘤周组织),对切片行免疫组织化学染色,了解生物信息学确定的癫痫疾病中潜在的铁死亡关键基因的表达情况。B部分:收集内科治疗的癫痫患者(癫痫组B,即SE-B组)及健康体检人群(对照组B,即Ctrl-B组)的一般资料,采集空腹血清,通过试剂盒检测铁死亡相关指标(血清铁、谷胱甘肽、丙二醛),通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测潜在的铁死亡关键基因的蛋白水平,并将SE-B组患者分为难治性癫痫与非难治性癫痫进一步研究。3.将5-6周的SD大鼠随机分为正常对照组(Ctrl组)、癫痫组(SE组)及Fer-1干预组(SE+Fer-1组),应用匹罗卡品构建慢性颞叶癫痫动物模型。其中SE+Fer-1组在癫痫动物模型制备成功后予以Fer-1(2.5umol/kg)腹腔注射,每日一次,共2周;相同的给药条件下,Ctrl组及SE组予以同等剂量的溶剂。第3周通过视频监控监测SE组及SE+Fer-1 组大鼠的自发性反复发作(Spontaneous Recurrent Seizures,SRSs);第9周处死全部大鼠,通过尼氏染色判断海马神经元的损伤情况,电镜下观察海马神经元中有无铁死亡相关的线粒体改变,使用试剂盒检测海马中铁死亡相关指标(铁、谷胱甘肽、丙二醛)的变化,经免疫组织化学染色了解海马中潜在的铁死亡关键基因的表达水平,取海马行实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)检测潜在关键基因的转录水平。此外予以Fer-1干预后探讨这些指标的变化。结果:1.利用生物信息学在GSE143272中以P<0.05为阈值,通过火山图发现共有1216个显著上调基因和1333个显著下调基因。在与铁死亡数据库中的驱动因子、抑制因子、标记因子取交集后,共找到78个差异表达基因,其中有45个基因是铁死亡驱动因子、36个基因是铁死亡抑制因子、6个基因是铁死亡标记因子。富集分析显示其显著富集于自噬、铁死亡、线粒体自噬等。在获得蛋白质互作网络后,筛选出前10个候选的癫痫中与铁死亡相关的潜在关键基因,分别是SQSTM1、MAPK1、MAPK3、MAPK14、STAT3、HIF1A、HSP更多A5、RELA、ATG5、MAP1LC3A。在数据集GSE186334的子集中验证,SQSTM1、ATG5、M4PK3、M4PK14的表达存在统计学差异(P<0.05),因此将这4个基因确认为癫痫疾病中潜在的铁死亡关键基因进行下一步研究。2.在A部分临床研究中,脑组织切片的免疫组织化学染色结果显示,癫痫患者(SE-A组,n=8)中MAPK14的表达显著高于对照患者(Ctrl-A组,n=8)(P<0.05),SQSTM1、ATG5、MAPK3的表达无明显差异。在B部分临床研究中,血清学结果显示:癫痫患者(SE-B组,n=45)的谷胱甘肽显著低于对照人群(Ctrl-B组,n=45)(P<0.05),铁、丙二醛无明显差异;癫痫患者ATG5显著高于对照人群(P<0.05),SQSTM1、MAPK3、MAPK14较对照组无显著变化;癫痫患者中的血清铁与MAPK14呈负相关,丙二醛与SQSTM1呈正相关(P<0.05);多因素Logistic回归分析提示,血清ATG5水平越高,癫痫风险越大(OR=1.031,95%CI 1.009-1.054,P<0.05);ROC曲线分析提示,血清ATG5可能对癫痫存在诊断价值(AUC=0.686,95%CI 0.575-0.796,P<0.05,最佳截断值为38ng/ml,灵敏度为71%,特异度为67%);将癫selleck产品痫患者分为难治性癫痫(n=25)与非难治性癫痫(n=20)后,二者的发作类型、血清中的铁死亡相关指标及潜在的铁死亡关键基因的表达水平均无显著差异。3.在成功获得匹罗卡品致痫大鼠后,存活的32只癫痫大鼠随机分入SE 组(n=16)及 SE+Fer-1 组(n=16),取正常大鼠作为 Ctrl 组(n=16)。造模成功2周后的视频监测中,SE组大鼠共14只出现SRSs,发生率达87.5%,SE+Fer-1组大鼠共10只出现SRSs,发生率达62.5%,无统计学意义。尼氏染色提示与Ctrl组的大鼠比较,癫痫大鼠出现了海马损伤,CA1、CA3区细胞排列紊乱、神经元丢失,DG区细胞增生(P<0.05),在Fer-1的干预下得到了显著改善。通过电镜观察到,在SE组及SE+Fer-1组大role in oncology care鼠的海马中,神经元的线粒体较Ctrl组缩小。在对铁死亡相关指标的检测中,SE组大鼠海马的丙二醛显著高于Ctrl组,Fer-1干预后显著下降(P<0.05);海马铁、谷胱甘肽在三组间均无统计学差异。免疫组织化学染色显示,在海马的CA1、CA3、DG区,潜在的铁死亡关键基因SQSTM1、ATG5、MAPK3、MAPK14在各组间的表达均无显著差异。qRT-PCR也未发现三组大鼠海马组织中SQSTM1、ATG5、MAPK3、MAPK14的mRNA水平的显著差异。结论:1.经生物信息学分析,SQSTM1、ATG5、MAPK3、MAPK14被确认为癫痫疾病中潜在的铁死亡关键基因。2.经临床验证,癫痫患者的脑组织中MAPK14表达显著升高;血清ATG5显著升高,且ATG5水平越高,癫痫风险越大,ATG5可能对癫痫存在诊断价值。3.在慢性颞叶癫痫大鼠的海马中,潜在的铁死亡关键基因SQSTM1、ATG5、MAPK3、MAPK14的表达及转录水平均未有显著变化,经Fer-1干预后也无明显改变。