目的:肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤,具有高发病率和高死亡率,已经成为全球癌症的主要死亡原因。随着诊疗技术的进步肺癌的治疗趋向于精准FRET biosensor化模式,其中基于免疫疗法的各种靶向治疗获得了重大的进步。表皮生长因子受体(Epithelial growth factorreceptor,EGFR)抑制剂包括吉非替尼、厄洛替尼和奥希替尼等在非小细胞肺癌的治疗上取得了较好的疗效,但这些药物的耐药性限制了药物的长期治疗效果。因此,开发新的肺癌治疗药物改善肺癌患者的治疗效果至关重要。甘草次酸CL 318952研究购买是从甘草中分离提取的五环三萜类天然化合物,对肺癌有着明显的抗癌活性,但其作用靶点和机制尚不明确。因此,本研究基于活性的蛋白质组分析技术(Activity-based protein profiling,ABPP)寻找甘草次酸治疗肺癌的具体蛋白靶点,探究其药理作用的分子机制。为药物的临床应用和新药的开发提供实验参考。方法:1.采用CCK8方法检测甘草次酸对不同肺癌细胞系的增殖的影响。2.采用流式细胞术检测甘草次酸对LLC细胞(小鼠Lewis肺癌细胞)凋亡的影响。3.采用激光共聚焦荧光成像和流式细胞术检测甘草次酸对LLC细胞内ROS(Reactive oxygen species,ROS)和Ca~(2+)浓度的影响。4.采用点击化学反应(Click-chemistry reaction)和凝胶电泳,检测甘草次酸能否占据炔基碘乙酰胺(IAA)探针在LLC细胞内的蛋白结合位点。5.采用串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)结合液相色谱串联质谱(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)技术对甘草次酸在LLC活细胞中直接作用的靶标蛋白进行定量分析和鉴定,并结合生信分析探究甘草次酸治疗肺癌的高可信度靶标蛋白和对所有靶标蛋白进行生物学功能分析。6.使用点击化学技术对重组鼠源Casp3和Prdx6蛋白进行IAA探针和甘草次酸的标记和竞争实验。7.采用荧光共定位成像探究甘草次酸能否竞争掉IAA探针在LLC细胞中占据的蛋白位点。8.采用分子对接技术探究甘草次酸与Casp3和Prdx6蛋白的具体结合位点和结合稳定性。9.采用流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜成像技术检测加入Casp3抑制剂后甘草次酸对LLC细胞凋亡,线粒体膜电位,细胞内ROS的影响。10.构建小鼠原位肺癌模型,采用小动物成像检测甘草次酸对体内肺癌的影响。11.采用LC-MS/MS技术分析甘草次酸给药组和模型组的小鼠肺癌组织差异蛋白表达谱。结果:1.甘草次酸对肺癌细胞生长抑制作用明显,甘草次酸处理24 h后对LLC细胞IC_(50)值为28.79μM,对Calu-1细胞IC_(50)值为29.72μM,对A549细胞IC_(50)值为30.10μM。2.甘草次酸能诱导LLC细胞凋亡,在甘草次酸10μM组和20μM组对LLC细胞的凋亡率分别为19.38%和86.76%(P<0.01)。3.甘草次酸能增加LLC细胞内ROS和Ca~(2+)水平(P<0.05)。4.甘草次酸能浓度依赖性的占据IAA探针在LLC细胞内蛋白的结合位点。5.ABPP技术和生物信息学分析鉴定出了甘草次酸直接作用的靶标蛋白Prdx6和Casp3,所有靶标蛋白主要参与内质网应激、细胞凋亡和线粒体膜通透性调节等通路。6.甘草次酸能浓度依赖性的占据IAA探针在Casp3和Prdx6蛋白上的结合位点。7.甘草次酸能有效竞争掉IAA探针在LLC活细胞中占据的蛋白位点。8.甘草次酸与Casp3和Prdx6蛋白能形成稳定的结合能。9.加入Casp3抑制剂后减缓了甘草次酸促进LLC细胞凋亡、线粒体膜电位下降以及细胞内ROS积聚的效果(P<0.05)。10.甘草次酸能减缓小鼠原位肺癌的生长速率(P<0.001),Casp3抑制剂对甘草次酸的抗肿瘤效果具有一定的拮抗作用(P<0.05)。11.甘草次酸给药后不同蛋白表达量明显发生改变,其中代谢通路富集在细胞内氧化应激、线粒体能量代谢和细胞凋亡等通路。结论:甘草次酸通过线粒体凋亡途径靶向Prdx6和Casp3,上调ROS水平,促进selleckchem LGX818氧化损伤,导致NSCLC细胞凋亡。