目的:在中医“咸伤肾”理论指导下,探索高盐对盐敏感高血压肾脏钠调控作用,及探讨补阳还五汤干预ENaC泛素化调控肾脏钠代谢的肾脏保护作用机制。本实验首先以网络药理学方法,将盐敏感高血压病设置为研究目标,以补阳还五汤作为研究载体,构建“补阳还五汤-药物靶点-盐敏感高血压-疾病靶点”的相互作用网络,并对这些靶点进行富集分析与生物功能分析,预测补阳还五汤干预盐敏感高血压的分子生物学机制。其次通过动物实验,以高盐饮食诱导Dahl盐敏感大鼠作为高血压模型,补阳还五汤灌胃干预,观察中药对盐敏感高血压大鼠血压、肾功、尿钠、肾脏形态、纤维化状态、肾小球基底膜、凋亡等肾脏保护作用。最后通过细胞实验,选用肾小管上皮细胞,观察高盐培养基对HK2细胞生长形态、增殖、ROS、凋亡、炎症因子分泌物的影响及补阳还五汤的细胞保护作用,并从ENaC泛素化相关信号通路部分阐释了补阳还五汤干预现代分子生物学机制,旨在明确“咸伤肾”致盐敏感高血压相关肾脏异常钠代谢作用机制,助力于了解盐敏感高血压发病机理,也可以为临床从中药复方寻找新的干预靶点提供理论依据。材料与方法:1基于网络药理学探讨补阳还五汤干预盐敏感性高血压潜在作用机制根据补阳还五汤成分信息,在TCMSP数据库中进行有效成分筛选,设置口服利用度OB值≥30%,类药性指数DL值≥0.18。筛选出有效成分后,在数据库中依次找出其有效成分对应靶点。在确定有效靶点之后,以靶点蛋白作为研究对象,在Uni Prot数据库(国际公认和标准化关于蛋白质序列和注释数据的综合资源数据库)中将靶点蛋白转化为靶点基因名。随后以Gene Cards在线数据库、OMIM数据库、TTD数据库、Pharm Gkb数据库、Drug Bank数据库为研究范围,以盐敏感性高血压(Salt-sensitive Hypertension)为关键词检索,收集盐敏感性高血压疾病所对应的靶点基因,并且以中位数做为依据进行靶点筛选。将补阳还五汤有效成分靶点与盐敏感性高血压疾病靶点取交集,绘制韦恩图。由交集靶点推测出中药有效成分,构建中药有效成分-交集靶点网络,根据中药有效成分与交集靶点之间连接情况筛选补阳还五汤干预盐敏感性高血压关键成分,进行PPI分析,构建蛋白相互作用网络。对交集蛋白进行GO分析和KEGG通路分析,推测补阳还五汤干预盐敏感高血压生物学机制以指导后续实验研究。2补阳还五汤对盐敏感高血压大鼠肾脏保护作用机制研究Dahl盐敏感大鼠60只,7周龄。随机数字表法分为空白组、模型组、补阳还五汤低剂量、补阳还五汤中剂量、补阳还五汤高剂量、氢氯噻嗪组。空白组予以0.3%低盐饲料饲喂,其余组喂以8%高盐饲料,5周后,盐敏感高血压大鼠血压显著升高,确定为高血压模型。在造模期间,中药组采用不同浓度补阳还五汤灌胃干预,西药组采用氢氯噻嗪灌胃干预,干预持续4周。观察各组大鼠血压,尿量。实验结束后收集大鼠血清,24h尿液,固定肾脏,收集肾小管与集合管。检测大鼠肾功及尿钠含量。Masson染色检测大鼠肾脏间质纤维化情况,PAS染色观察大鼠肾脏肾小球硬化差异,Tunel染色观察细胞凋亡状态,HE染色观察大鼠肾脏形态学差异,q PCR检测大鼠肾小管SGK1、NEDD4-2、ENaC mRNA表达。3基于ENaC泛素化探讨补阳还五汤对肾小管上皮细胞保护作用培养HK2细胞进行实验研究,培养基选用F12进行培养,培养基中加入1%青霉素/链霉素溶液,10%胎牛血清和1m Mol谷氨酰胺。细胞培养环境为37℃,CO_2浓度为5%。实验中药选用补阳还五汤进行干预,将配制好的中药颗粒混合均匀,等待完全融化之后静置10min,将中药溶液旋转蒸发浓缩。反应条件为每分钟200转,温度为50℃,药物浓缩后在真空冷凝干燥机中进行冻干处理48h并研磨成粉末。制备成冻干粉之后,用超纯水溶解冻干粉制备成母液备用。选取足够数量对数期生长的HK2细胞,将细胞分别分为空白组,高盐组,补阳还五汤低剂量组,补阳还五汤中剂量组,补阳还五汤高剂量组共5组。待细胞贴壁后进行造模干预。造模时,除空白组正常更换培养液,其余组别细胞在F12培养基中加入150m Mol Na Cl溶液干预24小时。随后干预组分别选用不同浓度补阳还五汤干预24h(培养液中含生药浓度分别为5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml)。干预结束后,CCK-8实验验证补阳还五汤对HK2细胞损伤的保护作用,高内涵分析系统观测细胞数量,荧光定量PCR检测HK2细胞SGK1、NEDD4-2、ENaC mRNA表达,Western blot检测SGK1、NEDD4-2、ENaC蛋白含量,流式细胞仪检测细胞凋亡与ROS表达,Elisa检测细胞培养液中IL-1β与IL-18含量。结果:1补阳还五汤干预盐敏感高血压病的网络药理学研究本部分研究共收集123种化学成分、药物作用靶点1402个,779个盐敏感性高血压靶点,共有93个交集靶点,通过生物学功能分析,结果显示主要涉及细胞增殖、凋亡、血管生成等方面,通路富集分析发现补阳还五汤干预盐敏感性高血压可能与影响RAS信号通路、肾素分泌参与的信号通路、醛固酮调节下的钠重吸收信号通路相关,主要指标有:IR、PLA、RAS、NEDD4-2、PDK等。2补阳还五汤对盐敏感高血压大鼠肾脏保护作用2.1补阳还五汤对盐敏感高血压大鼠血压影响动物实验结果表明,与空白组相比,模型组大鼠收缩压及舒张压显著增高(P<0.05);补阳还五汤可显著降低盐敏感高血压大鼠收缩压及舒张压水平,差异具有统计学意义。2.2补阳还五汤可保护盐敏感高血压大鼠肾功及促进尿钠排泄实验结果表明,模型组大鼠尿液中尿蛋白含量显著增高,同时尿液白细胞和上皮细胞含量也显著增高,24h尿量,尿钠及血清UREA显著增加,尿肌酐下降(P<0.05)。提示大鼠肾脏出现炎症性损伤,肾小管已经开始发生病变。补阳还五汤可以显著降低大鼠血清UREA及尿蛋白,减少尿白细胞及上皮细胞排出,增加尿量及尿肌酐,尿钠排泄(P<0.05),起到一定程度肾脏保护作用。2.3补阳还五汤对盐敏感高血压大鼠肾脏保护作用实验结果表明,模型组大鼠出现肾小球肥大,系膜细胞及系膜基质增生,肾小管肿胀,上皮细胞空泡变性,基底膜增厚,大量胶原纤维沉积,凋亡细胞增加等表现。补阳还五汤可以显著改善高盐引起的肾脏损伤等一系列表现。2.4补阳还五汤调节钠代谢分子机制研究实验结果表明,与空白组相比,高盐饮食可显著增加SGK1、ENaC mRNA表达,降低NEDD4-2 mRNA表达(P<0.05);而补阳还五汤可显著降低SGK1、ENaC mRNA表达,增加NEDD4-2 mRNA表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果证实,补阳还五汤可以显著减少大鼠肾小管组织SGK1含量,增加泛素连接酶NEDD4-2含量,从而促进上皮钠通道ENaC泛素化降解,减少HK2细胞钠离子重吸收,起到高盐环境下HK2细胞保护作用。3补阳还五汤促进ENaC泛素化抑制钠离子重吸收发挥肾脏保护作用3.1补阳还五汤可以促进HK2细胞增殖作用CCK-8结果表明,与空白组相比,高盐组HK2细胞活性显著降低,镜下观测细胞数目明显减少,形态出现异常改变,同时培养液中漂浮死细胞增多;与高盐组相比,加入补阳还五汤可显著提升细胞活性,增加细胞数目,保护细胞正常生长(P<0.05)。高内涵实验结果表明,高盐可以显著抑制HK2细胞增殖,破坏细胞正常生长速度,而补阳还五汤能够促进细胞增殖,减少高盐所致细胞损伤。其实验结果呈现剂量-效果依赖性关系。中剂量效果最佳。3.2补阳还五汤可抑制HK2细胞ENaC泛素化相关信号通路表达实验结果表明,与空白组相比,150mmol高盐刺激可显著增加SGK1、ENaC mRNA及蛋白表达,降低NEDD4-2 mRNA及蛋白表达(P<0.05);而补阳还五汤可显著降低SGK1、ENaC mRNA及蛋白表达,增加NEDD4-2 mRNA及蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果证实,补阳还五汤可以显著减少SGK1含量,增加泛素连接酶NEDD4-2含量,从而促进上皮钠通道ENaC泛素化降解,减少HK2细胞钠离子重吸收,起到高盐环境下HK2细胞保护作用。3.3补阳还五汤可抑制F-actin表达,改善HK2细胞形态实验结果表明,当细胞外钠离子浓度在150mmol/l时,与空白组相比较,高盐组内皮细胞的F-actin明显增加,缩短变粗,向细胞中央固缩,且细胞形态发生显著改变;补阳还五汤可以显著改善细胞形态,降低F-actin表达,促进细胞形态恢复正常。3.4补阳还五汤可抑制HK2细胞凋亡实验结果表明,与空白组相比,高盐组在加入150mmol/l Na Cl后,早期凋亡及晚期凋亡比例均显著升高(P<0.05);与高盐组相比,补阳还五汤处理能显著抑制细胞凋亡,凋亡抑制效果呈现剂量依赖性,其中中剂量组抑制凋亡效果最为显著(P<0.05)。3.5补阳还五汤可抑制HK2细胞ROS表达实验结果表明,高盐组HK2细胞活性氧ROS表达显著上升(P<0.05);而与高盐组相比较,补阳还五汤可显著降低ROS表达(P<0.05),其干预作用呈现剂量依赖性,中剂量中药效果最为显著。3.6补阳还五汤可抑制HK2细胞炎症反应,减少上清液中IL-1β和IL18等炎症因子分泌实验结果表明,150mmol/l高盐干预HK2细胞后,细胞培养液中IL-1β与IL-18含量显著升高(P<0.05),提示高盐在抑制上皮钠通道泛素化后,大量钠离子重吸收会诱导细胞凋亡,释放相关炎症因子;而补阳还五汤能够显著改善高盐诱导的炎症反应,减少细胞释放炎症因子进入细胞培养液。其干预效果呈现剂量依赖性,中剂量效果最为显著(P<0.05)。结论:1本研究基于网络药理学初步探索补阳还五汤干预盐敏感高血压的主要活性成分以及潜在分子学机制,其可能干预的生物过程可能与营养水平、氧化应激、外源性刺激、细胞对化学应激的反应,脂多糖、氧水平等密切相关;信号通路涉及脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、AGE-糖尿病并发症中的RAGE信号通路、化学致癌活性氧物质、MAPK信号通路、HIF-1信号通路、IL-17信号通路和上皮钠通道泛素化相关信号通路等。2通过动物实验证实,补阳还五汤对盐敏感高血压大鼠肾脏保护作用显著。其可以改善大鼠肾功,降低肾小管细胞尿钠重吸收,减轻肾脏肾小球基底膜硬化,减轻肾脏纤维化情况,降低肾脏组织细胞凋亡。其干预作用与其促进上皮钠通道ENaCCaspase抑制剂泛素化,减少钠离子重吸收密切相关。3细胞实验结果表明,补阳还五汤可以降低HK2细胞SGK1含量,激活泛素连接酶NEDD4-2基因及蛋白表达,促进NEDD4-2与HK2细胞表面上皮钠通道相结合,使ENaC泛素化被细胞内吞,从而减少细胞膜表面钠离子通道数量,减少钠离子重吸收,维持钠离子内环境稳定性,减少细胞内ROS积累,降低细胞凋亡数量,抑制HK2细胞炎症因子释放,改善HK2细胞生长状态GNE-140研究购买,增加HK2细胞增殖,部分阐释了补阳还五汤促进ENaC泛素Congenital infection化抑制钠离子重吸收的肾脏保护作用机制。