目的:1.通过文献分析,归纳总结中医药在治疗肝郁脾虚型肝纤维化中的理论及用药特点;2.观察和血柔肝方(HXRGD)治疗肝郁脾虚型慢性乙型病毒性肝炎(CHB)肝纤维化患者的临床疗效;3.通过体内实验研究HXRGD对肝纤维化大鼠肝脏中NOX4/ROS通路及铁死亡标志物的影响;4.通过体外实验研究HXRGD能否通过NOX4/ROS通路促进HSC铁死亡,发挥抗肝纤维化的作用。方法:1.在中国知网、万方数据库、维普数据库、Pubmed、Web of Science中分别以“疏肝健脾”、“肝郁脾虚”、“调和肝脾”和“肝纤维化”作为关键词进行文献检索,去除重复、会议论文、未记录方剂组成文献、经验性质及证型研究文献后,提取文献中方药组成,对所有方药进行筛选,相同组成的方药仅记录一次,依据《中国药典2020版》和《中华本草》进行药物名称规范,分析药物的性味归经,并进行复杂网络分析及关联规则分析。2.纳入2022年1月至2023年8月就诊于新疆医科大学附属中医医院肝病科经肝组织活检或Fibro Touch诊断伴有肝纤维化的肝郁脾虚型CHB患者48例,随机数字表法分为治疗组23例和对照组25例,治疗组给与HXRGD联合核苷类药物抗病毒治疗,对照组单用核苷类药物抗病毒治疗,两组疗程均为24周。于治疗前后收集两组患者的一般资料、实验室检查、肝脏硬度(LSM)、中医证候积分,计算肝纤维化4因子指数(FIBBioabsorbable beads-4)、天门冬氨酸氨基转移酶和血小板比值(APRI),进行统计学分析,比较治疗组和对照组治疗前后组内和组间肝纤维化程度,评价HXRGD治疗肝郁脾虚型CHB肝纤维化的临床疗效。3.SD大鼠60只采用随机数字表法分为6组,每组10只。分组如下:(1)正常对照组,(2)模型组,(3)秋水仙碱组,(4)HXRGD低剂量组,(5)HXRGD中剂量组,(6)HXRGD高剂量组。除正常对照组外其余5组以四氯化碳制备肝纤维化大鼠模型,至造模第8周时进行肝纤维化大鼠模型评估,造模成功后分组干预:正常对照组和模型组以蒸馏水灌胃,秋水仙碱组以0.02 mg/m L剂量秋水仙碱灌胃,HXRGD低、中、高剂量组分别以0.927 g/m L、1.854 g/m L、3.708 g/m L剂量灌胃,灌胃体积均为10 m L/kg,连续4周。采用HE、Masson染色观察各组大鼠肝组织炎症和纤维化程度,并进行Ishak评分;试剂盒检测各组大鼠肝组织GSH、GSSG、MDA、Fe、Fe~(2+)水平;DCFH-DA探针检测大鼠肝组织ROS水平;Western blot、RT-q PCR分别检测大鼠肝组织中NOX4蛋白、NOX4 m RNA表达量,进行统计分析。4.SD大鼠18只随机数字表法分为正常对照和HXRGD组,HXRGD组大鼠给予浓度为3.708 g/m L HXRGD灌胃,正常对照组给与蒸馏水灌胃,灌胃体积均为10m L/kg,每日1次,连续6天,第7天重复给药2次,取血清处理后备用;以CCK8法从2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%浓度的含药血清中筛选低、中、高剂量。HSC-T6细胞分为7各组,分别为(1)空白对照组,(2)正常大鼠血清组,(3)TGF-β1+正常大鼠血清组,(4)TGF-β1+Erastin组,(5)TGF-β1+HXRGD低剂量含药血清组,(6)TGF-β1+HXRGD中剂量含药血清组,(7)TGF-β1+HXRGD高剂量含药血清组。分组进行干预,CCK8和Annexin V-APC/7-AAD法分别检测细胞的增殖和凋亡情况,试剂盒分别检测HSC-T6细胞GSH、GSSG、Fe、MDA水平,DCFH-DA探针检测细胞中ROS水平;Western blot、RT-q PCR分别检测细胞NOX4蛋白、NOX4 m RNA表达量,BODIPY 581/591 C11探针检测细胞脂质ROS水平并以激光共聚焦显微镜观察,透射电镜观察HSC-T6细胞线粒体形态。结果:1.最终从181篇文献中提取方剂181个,共获取193味中药,使用频次排在前10的为:柴胡(141)、白术(123)、白芍(108)、茯苓(102)、甘草(96)、黄芪(96)、丹参(92)、鳖甲(68)、党参(62)、当归(61)。药物性味归经中以性寒药物最多,性热药物最少;以苦味药最多,甘味药次之;归经以肝脾胃三经最多。在复杂网络分析中发现强链接41个,中等链接65个,弱链接2912个,其核心药对为柴胡-白术。关联规则分析结果显示了105个关联药物组合,其中两个药物配对的关联分析结果共14个,三个药物配对的关联分析结果共91个。将药物频次前30位的中药进行聚类分析,可分为3类:疏肝理气、益气健脾渗湿类,理气活血、化瘀散结类以及清热利湿、行气散瘀类。2.共纳入48例患者,其中男性28例、女性20例,平均年龄49.77±9.71岁;治疗组23例,对照组25例。两组患者基线资料无明显差异(P>0.05),资料均衡可比。治疗后,治疗组的中医证候积分、LSM、APRI、ALT、GGT水平较治疗前明显下降(P<0.05);对照组较治疗前相比,PT、FIB、GGT、IBIL水平均明显下降(P<0.05)。治疗后治疗组BUN、HBs Ag、LSM均显著低于对照组(P<0.05)。3.(1)HE染色下观察与模型组相比,HXRGD能使肝组织内炎症及纤维化程度有不同程度的降低,Masson染色与模型组相比,HXRGD能减轻肝脏内胶原纤维沉积,程度最明显;与模型组相比,HXRGD能明显降低肝纤维化大鼠Ishak评分(P<0.001);(2)肝纤维化大鼠肝组织中GSH水平明显降低,GSSG、MDA、Fe和Fe~(2+)以及NOX4、NOX4 m RNA、ROS表达量明显升高。与模型组相比,HXRGD能明显升高肝纤维化大鼠肝组织中GSH水平、并降低GSSG、MDA、水平,Fe及Fe~(2+)及NOX4、NOX4 m RNA、ROS表达量(P<0.001),表明HXRGD在一定程度上恢复了肝脏的抗氧化能力,减少脂质过氧化物及铁的累积,并抑制了NOX4/ROS通路。4.(1)CCK8法筛选出以5%、10%、20%的HXRGD含药血清分别作为低、中、高剂量组;(2)FUT-175浓度Erastin诱导活化HSC-T6细胞中Fe、MDA、脂质ROS、GSSG水平均明显升高,GSH明显下降,同时使活化的HSC-T6细胞中ROS、NOX4、NOX4m RNA表达量显著升高(P<0.001);(3)HXRGD高剂量含药血清使活化的HSC-T6中GSH明显降低,GSSG、脂质ROS、MDA、Fe、NOX4、NOX4m RNA、ROS水平明显升高(P<0.001),总体优于Erastin。表明HXRGD使活化的HSC-T6细胞中发生脂质过氧化、脂质过氧化物的积累以及铁沉积。另外HXRGD含药血清干预后活化的HSC-T6细胞线粒体形态发生变化,线粒体变小、膜密度增加,线粒体嵴模糊Erastin溶解度甚至消失,部分线粒体出现外膜破裂,呈现出铁死亡时线粒体的典型特征改变。结论:1.肝郁脾虚型肝纤维化的治疗以“和法”为原则,不仅体现了疏肝健脾的治则,更突显出调和气血、苦辛分消、寒温并用的特点,和法的运用灵动而不拘束,在肝纤维化的治疗中应用广泛,值得深入探讨。2.HXRGD能有效减轻肝郁脾虚型CHB肝纤维化患者肝纤维化程度,改善症状,降低ALT水平,显示出较好的临床疗效。3.HXRGD能减轻大鼠肝组织肝纤维化程度,可抑制NOX4/ROS通路,减少GSH消耗,降低脂质过氧化物积累、减少Fe在肝脏中的蓄积,表明HXRGD可下调肝纤维化大鼠肝脏中NOX4/ROS通路并降低了铁死亡相关标志物水平。4.HXRGD含药血清能上调NOX4/ROS通路,增加活化的HSC-T6中GSH的消耗以及Fe的蓄积,并增加脂质ROS和脂质过氧化物的累积,使线粒体缩小并呈现出铁死亡形态特征,表明HXRGD可通过上调NOX4/ROS通路促进活化的HSC铁死亡发挥抗肝纤维化作用。