研究背景与目的胰腺癌是一种常见的消化道肿瘤,具有恶性程度高和预后差的特点。在当前,临床上给予手术切除是根治胰腺癌的主要手段。然而,胰腺癌早期临床症状不典型,约80%的患者确诊时已处于晚期丧失手术切除的可能。对于晚期患者来说,单一放疗或联合化疗的治疗效果并不理想,预后极差,因此对于胰腺癌发生发展的肿瘤分子机制,是亟需阐明的,从而去探寻新的药物靶点。蛋白质的稳态失衡在肿瘤的发生发展中起着关键作用。去泛素化酶调控底物蛋白的稳定性,从而维持细胞内蛋白稳态平衡。USP1是一种去泛素化酶,在肝癌、卵巢癌、乳腺癌和神经胶质瘤中高表达,并参与调控DNA损伤应答和细胞增殖迁移等生物学功能。由于肿瘤的异质性,USP1在胰腺癌发生发展中的作用机制尚不明确。本论文通过生物信息学分析USP1在胰腺癌组织中的表达水平以及临床预后的相关性;利用USP1敲低和诱导过表达的胰腺癌细胞系,检测USP1对肿瘤细胞增殖和迁移能力的影响;明确干预USP1介导胰腺癌细胞对顺铂化疗敏感性的作用;探究USP1结合自噬相关蛋白调控细胞自噬的分子机制;通过裸鼠移植瘤模型探究USP1对体内胰腺癌细胞成瘤能力的影响。研究方法1.利用TCGA数据库分析USP1在胰腺癌组织中的表达水平以及与患者临床预后的相关性;应用Western Blotting实验检测USP1在正常胰腺导管细胞和胰腺癌细胞的蛋白表达水平。2.构建稳定敲低和诱导过表达USP1的胰腺癌细胞系,并应用qRT-PCR和Western Blotting实验评估USP1的敲低和过表达效率。应用CCK8、EdU掺入实验和平板克隆实验检测USP1对胰腺癌细胞增殖和克隆形成能力的影响。3.应用Transwell迁移实验检测USP1对细胞迁移能力的影响;应用Western Blotting实验检测USP1对上皮间充质转化标志物表达的影响。4.应用CCK8实验检测胰腺癌细胞中,沉默USP1对铂类化疗药物顺铂、卡铂和奥沙利铂以及吉西他滨敏感性的影响;应用CCK8实验检测USP1特异抑制剂SJB3-019A与顺铂联用对胰腺癌细胞的杀伤作用。5.应用Western Blotting及荧光检测USP1对细胞自噬标志物LC3B-II和自噬流的调控作用;应用免疫共沉淀实验筛选与USP1结合的自噬相关蛋白。6.应用qRT-PCR和Western Blotting检测ULapatinib供应商SP1对ATG14 mRNA和蛋白表达水平的影响;应用免疫共沉淀实验检测USP1与ATG14蛋白的相互作用;蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞检测USP1对ATG14蛋白半衰期的影响。7.应用裸鼠异种移植瘤模型,检测USP1对裸鼠肿瘤生长的影响;应用Western Blotting检测裸鼠肿瘤组织中USP1、ATG14蛋白的表达水平。研究结果1.USP1在胰腺癌中高表达并与预后不良有关TCGA数据库分析显示USP1在胰腺癌患者中高表达,并且高表达USP1的患者总体生存期较低。Western Blotting结果显示与正常胰腺导管细胞相比,USP1在胰腺癌细胞中呈现高表达。2.敲低USP1抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化能力敲低USP1抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移能力。Western Blotting结果显示敲低USP1显著下调间质标Transfusion-transmissible infections志物N-cadherin和Snail的表达,显著促进上皮标志物E-cadherin的表达。3.敲低USP1增强胰腺癌细胞对顺铂的敏感性与对照组相比,敲低USP1组PANC-1细胞对顺铂的敏感性增加,而敲低USP1对其他铂类药物卡铂、奥沙利铂以及吉西他滨的敏感性没有明显影响。4.USP1抑制剂与顺铂协同增强对胰腺癌细胞的杀伤能力使用CompuSyn计算联用指数,USP1抑制剂SJB3-019A与顺铂联合使用,具有一定的协同杀伤胰腺癌细胞的作用。5.USP1结合自噬相关蛋白ATG14,促进细胞自噬Western Blotting和荧光实验结果显示USP1促进LC3B-Ⅱ的蛋白表达和自噬流。免疫共沉淀实验结果显示USP1与自噬相关蛋白ATG14存在相互作用。6.USP1调控ATG14蛋白的半衰期qRT-PCR和Western Blotting实验结果表明USP1不影响ATG14 mRNA表达,但依赖其去泛素化酶活性调节ATG14蛋白的表达。CHX蛋白稳定性实验表明,USP1过表达增加ATG14蛋白的稳定性。7.敲低USP1抑制裸鼠体内胰腺癌细胞的生长与对照组相比,敲低USP1组肿瘤体积减小,重量降低,而裸鼠体重未有改变,表明沉默USP1抑制裸鼠体内胰腺癌细胞的DS-3201 MW成瘤能力。Western Blotting结果显示沉默USP1组裸鼠肿瘤组织中的ATG14蛋白表达水平降低。研究结论1.USP1在胰腺癌组织中高表达,并与临床预后显著负相关;2.USP1促进胰腺癌细胞的增殖、迁移以及裸鼠体内成瘤能力;3.USP1抑制剂与顺铂联用显示出协同抗肿瘤效果;4.USP1调控ATG14蛋白稳定性进而促进细胞自噬。