背景:肝内胆管癌是指起源于肝实质内二级胆管近端的胆道上皮细胞的恶性肿瘤,其症状隐匿、恶性程度高、预后差。作为一种侵袭性肿瘤,手术切除及化疗是其主要的治疗手段。鉴于目前化疗药物效果有限且容易耐药,因此探索安全、普适、有效的抗肝内胆管癌药物具有重大意义。华蟾毒它灵具有较强的抗肿瘤作用,但其对肝内胆管癌的影响及具体作用机制尚不明确。目的:本研究旨在通过华蟾毒它灵体外干预人肝内胆管癌细胞,探讨其对肝内胆管癌细胞生物学特性(增殖及凋亡)的影响,并基于蛋白质组学及磷酸化修饰组学联合分析探究其作用的分子机制,为其应用于临床治疗提供理论支撑。方法:(1)使用不同终浓度(0、0.1、0.25、0.5、1.0和2.0μM)的华蟾毒它灵溶液分别干预RBE及HCCC-9810细胞24 h、48 h和72 h,采用CCK-8法检测细胞活性;(2)通过细胞集落形成实Barasertib供应商验研究华蟾毒它灵对RBE及HCCC-9810细胞克隆形成能力的影响;(3)利用流式细胞术检测华蟾毒它灵对RBE及HCCC-9810细胞凋亡的影响;(4)利用蛋白质组学和磷酸化修饰组学技术鉴定华蟾毒它灵干预RBE细胞的蛋白及磷酸化位点表达水平变化;(5)使用R语言进行数据处理及图片可视化分析;(6)使用DAVID、Metascape、SIGNOR、Phospho Site Plus等数据库及在线网站进行GO、KEGG、蛋白互作、激酶底物调控网络等生信分析;(7)采用Western blot法检测富集通路中Oral relative bioavailability相关蛋白的表达变化。结果:(1)CCK-8检测结果表明华蟾毒它灵可显著抑制肝内胆管癌细胞活性,其在RBE及HCCC-9810细胞的IC50分别为0.342μM和0.421μM。细胞集落形成实验结果表明华蟾毒它灵可显著抑制肝内胆管癌细胞克隆形成。流式细胞术检测结果显示华蟾毒它灵可显著促进肝内胆管癌细胞凋亡;(2)蛋白质组学共鉴定6,740个蛋白,其中华蟾毒它灵干预后显著上调蛋白200个(FC(CB/Ctr)>1.25,p<0.05),下调蛋白418个(FC(CB/Ctr)<0.8,p<0.05)。KEGG通路富集结果显示:上调蛋白主要富集在p53信号通路、氨基酸的生物合成以及细胞凋亡等信号通路;下调蛋白主要富集在类固醇生物合成,萜类化合物的生物合成以及泛素化介导的蛋白降解等信号通路。(3)磷酸化修饰组学共鉴定16,445个磷酸化位点,其中显著上调的磷酸化位点321个(FC(CB/Ctr)>1.25,p<0.05),显著下调的磷酸化位点1,5selleckchem SCH77298441个(FC(CB/Ctr)<0.8,p<0.05),功能富集分析发现上调的磷酸化位点富集的最显著变化通路为细胞对DNA损伤刺激的反应,激酶底物富集分析结果显示ATM激酶显著激活。(4)Western blot进一步验证结果显示凋亡和DNA损伤通路相关蛋白Cleaved caspase-3、γH2AX、p-ATM-S1981、p-CHK2-T68以及p-p53-S15表达水平在华蟾毒它灵干预后明显升高,而凋亡调控蛋白Bcl-2表达下调。结论:华蟾毒它灵能够显著抑制肝内胆管癌细胞增殖,并通过DNA损伤激活ATM/CHK2/p53信号通路进而促进细胞凋亡,因此华蟾毒它灵有望成为一种潜在的抗胆管癌药物。