研究背景化疗是临床各种血液系统肿瘤和其它实体肿瘤的常规治疗方法,化疗药物不仅对肿瘤细胞产生破坏和抑制作用,对机体的正常细胞也造成一定损伤,且会引起如恶心、呕吐、脱发、口腔疼痛、皮肤发红等副作用。骨髓抑制是化疗诱发的最严重毒副作用。由于化疗药物对骨髓造血功能造成的损害会导致外周血红细胞、白细胞和血小板的数量极度减少,故机体会出现贫血、感染、出血等症状,严重威胁患者的生命安全。既往研究表明,骨髓抑制主要是由于造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)在化疗中严重受损;最新研究发现,在化疗过程中骨髓造血微环境也可能受损伤导致其对HSCs的支持能力下降从而影响造血功能,这一损伤因素也不可忽视。间充质干细胞(Mesenchymal stem/stromal cells,MSCs)是构成骨髓造血微环境的重要细胞成分,可通过与HSCs相互作用以及分泌多种可溶性细胞因子来支持和调控HSCs的自我更新和分化发育。骨相关间充质干细胞(Bone-associated mesenchymal stem cell,BA-MSCs)来源于骨髓的骨内膜,是造血微环境形成和维持的重要成分,在机体造血活动中发挥支持和调selleckchem MG132控的作用。在HSC移植过程中,若宿主造血微环境因放疗或化疗受到严重破坏,将导致HSC造血重建失败。然而,目前关于化疗损伤BA-MSCs的相关研究较少,化疗中BA-MSCs受损程度及其相关机制尚不清楚。本研究就化疗对BA-MSCs的损伤及其机制进行了探索。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)是一种结构类似于尿嘧啶的衍生物,通过抑制胸苷酸合成酶而影响细胞DNA的复制过程,是临床常用的经典且高效的抗肿瘤化疗药物。本研究采用5-FU作为刺激因素来建立化疗诱导BA-MSCs损伤的细胞和动物模型,探索了化疗对BA-MSCs的损伤效应及相关机制,并进一步探索了血小板来源线粒体对5-FU化疗所致BA-MSCs损伤的修复作用。研究目的阐明5-FU化疗所致BA-MSCs损伤作用并初步揭示其损伤机制,进而探索血小板来源线粒体对5-FU化疗所致BA-MSCs损伤的修复效应。研究方法在化疗药物5-FU作用下建立BA-MSCs损伤的细胞和动物模型。首先,通过流式细胞仪检测5-FU作用下BA-MSCs凋亡和细胞周期的改变,以及其造血支持能力的改变;通过q RT-PCR检测BA-MSCs造血调控因子基因的表达;通过ELISA检测BA-MSCs分泌干细胞因子(Stem cell factor,SCF)和趋化因子配体12(C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12)的水平。然后从线粒体损伤角度进一步探索5-FU诱导BA-MSCs损伤的机制:通过透射电镜检测线粒体形态变化;q RT-PCR检测线粒体融合和分裂基因表达水平;Western blot检测线粒体分裂蛋白Drp1与线粒体内膜融合蛋白Opa1表达水平;采用流式细胞仪检测线粒体膜电位和化学发光仪检测ATP含量来评估线粒体的功能。继而采用血小板来源线粒体在体外修复5-FU对BAMSCs的损伤,并检测BA-MSCs的凋亡和造血支持能力的变化以及线粒体形态的改变,以评估血小板来源线粒体对5-FU化疗所致BA-MSCs损伤的修复效果。最后,进一步通过q RT-PCR检测BA-MSCs中线粒体融合和分裂基因的表达,来初步解析血小板来源线粒体发挥治疗作用的机制。研究结果1.从细胞水平研究证实了5-FU对BA-MSCs及其线粒体的损伤首先分离小鼠原代BA-MSCs并进行鉴定。为了研究5-FU所致BA-MSCs的损伤,在体外建立了5-FU诱导小鼠BA-MSCs损伤的细胞模medial migration型。12.5μM 5-FU刺激BA-MSCs 48 h后,流式细胞仪检测到BA-MSCs在5-FU的刺激下,凋亡细胞比例增多、细胞周期发生阻滞。为了分析5-FU处理后BA-MSCs的造血调控功能,本研究将BA-MSCs与骨髓细胞(Bone marrowselleck产品 cells,BMCs)共培养后,用流式细胞仪检测BMCs各阶段的分化发育情况以及细胞周期的变化,结果发现造血干细胞和造血祖细胞向下游分化,BMCs细胞周期阻滞,说明5-FU损伤了BA-MSCs的造血调控功能。5-FU刺激BA-MSCs后,q RT-PCR检测结果发现造血调控因子基因Scf、Cxcl12、Csfg、Csfm、Csfgm和Il6表达下调;ELISA检测结果发现造血调控因子SCF和CXCL12分泌水平下降。综合以上结果表明5-FU在体外对BA-MSCs的造血调控功能造成严重损伤。为了进一步研究5-FU所致BA-MSCs线粒体的损伤,在体外通过透射电镜观察到5-FU损伤的BA-MSCs中线粒体融合增加;q RT-PCR检测发现线粒体融合基因Opa1、Mfn1和Mfn2的表达显著上调,线粒体分裂基因Drp1和Fis1的表达也显著上调;Western blot检测BA-MSCs线粒体分裂蛋白Drp1与线粒体内膜融合蛋白Opa1,结果显示5-FU对BA-MSCs的刺激使线粒体内膜融合蛋白Opa1表达上调;对5-FU刺激后的BA-MSCs的线粒体膜电位和ATP含量进行检测,结果显示线粒体膜电位水平和ATP含量均显著下降。以上结果提示5-FU在体外作用影响了BA-MSCs的线粒体动力学,并且对BA-MSCs线粒体的功能造成严重损伤。2.从动物水平研究证实了5-FU对BA-MSCs及其线粒体的损伤为了研究5-FU在体内对BA-MSCs造成的损伤,建立了5-FU诱导小鼠骨髓抑制的动物模型。小鼠经腹腔注射5-FU 6天后,分离BA-MSCs和BMCs进行损伤相关分析,结果发现BA-MSCs凋亡增多、细胞周期被抑制,BMCs中造血干细胞和造血祖细胞数量明显减少。q RT-PCR检测发现造血调控因子基因Thpo、Csfg、Csfm、Csfgm和Il6表达显著下调。以上结果说明5-FU化疗在体内对BA-MSCs的造血调控功能造成严重损伤。为了进一步研究5-FU在体内对BA-MSCs线粒体的损伤,通过q RT-PCR检测发现5-FU诱导的骨髓抑制小鼠的BA-MSCs线粒体融合基因Opa1和Mfn1表达显著上调,线粒体分裂基因Drp1、Mff、Fis1和Mid51的表达也显著上调。对5-FU体内刺激后的BA-MSCs的线粒体膜电位和ATP含量进行检测,结果显示线粒体膜电位水平和ATP含量均显著下降。以上结果提示5-FU在体内诱导BA-MSCs线粒体动力学发生改变,并且对BA-MSCs线粒体的功能造成严重损伤。3.研究证实了血小板来源线粒体可减轻5-FU所致BA-MSCs的损伤为了探索血小板来源线粒体是否可减轻5-FU所致BA-MSCs损伤,本研究首先对血小板来源线粒体进行形态、纯度和功能鉴定,证明成功分离到高纯度并具有生物功能的血小板来源线粒体。在体外研究中,将血小板来源线粒体与5-FU损伤的BA-MSCs共培养24 h后发现血小板来源的线粒体可成功转移到BA-MSCs中。5-FU损伤的BA-MSCs经血小板来源线粒体治疗后,BA-MSCs的凋亡减轻,造血调控能力得到改善。体外共培养实验结果表明,血小板来源线粒体转移的BA-MSCs促进了BMCs增殖并改善了BA-MSCs对BMCs自我更新和分化发育的支持能力。进一步研究发现经血小板来源线粒体治疗后的BA-MSCs,通过上调线粒体融合基因Opa1、Mfn1和Mfn2的表达来调节线粒体动力学,减轻了5-FU损伤的BA-MSCs的凋亡并提高了其造血支持能力。以上结果证明血小板来源线粒体可减轻5-FU诱导的BA-MSCs凋亡,可提高受损的BA-MSCs的造血调控能力。结论通过体内和体外研究证实了5-FU化疗诱导BA-MSCs及其线粒体严重受损,血小板来源线粒体可减轻BA-MSCs的凋亡并改善其造血调控功能的损伤,从而有助于化疗后机体骨髓造血功能的恢复。这一发现为探索化疗所致BA-MSCs损伤的治疗策略提供了新的实验依据。