研究背景与目的登革热(dengue)是登革病毒(dengue virus,DENV)经伊蚊(Aedes)传播引起的急性虫媒传染病。登革病毒感染后具有隐性感染、登革热和登革出血热等多种临床表现形式。比较典型的登革热临床表现为起病急骤,高热,头痛,肌肉和关节剧烈酸痛,部分患者会出现皮疹、出血、淋巴结肿大、白细胞计数减少、血小板减少等症状。本病主要在热带和亚热带地区流行,我国云南、广东、香港、澳门等地是登革热流行区,曾出现多次局部登革热流行。目前临床上的抗病毒药物存在研发困难,而且效果普遍较差的特点。与一般传染病不同,登革病毒是通过虫媒传播方式在人群中流行的,被登革病毒感染的患者目前大多数只能采取对症治疗的处理方法,然而对症治疗达不到抑制病毒复制和抗病毒的作用,登革热患者临床症状严重,病程长,影响正常生活。因此登革热目前亦尚无特效的抗病毒治疗方法。因此,亟需一种特效的抗登革病毒药物为此类疫情防控提供技术手段。Pevonedistat化学结构反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides,ASOs)(以下简称ASO)是指与靶基因或m RNA互补并产生特异性基因变构效应的一段单链类DNA或RNA序列,通常由15-30个核苷酸组成的靶基因配对的单链DNA或RNA序列,通过化学合成和生物修饰的方式生产。其作用是沉默或降解基因从而抑制基因表达。ASO因具备高度特异性、高效性和安全低毒等优势,在基因治疗等领域展现出了广阔的应用前景。如:诺西钠生是首个获批用于脊髓性肌萎缩症的药物,也是首个证明脊髓性肌萎缩症患者增加体内特定蛋白表达可以改善运动功能的药物。伊诺特生已被证明可以用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病。依特立生在人体内可以使肌营养不良蛋白纤维的数量增加,肌营养不良素的平均染色强度也相应增加,因此被证明可以治疗杜氏肌营养不良症。本研究旨在筛选可高效抑制登革病毒的ASO靶点,进一步评估和优化其抗病毒效率,最后获得抗登革病毒的反义寡核苷酸候选靶点,为后续研发相关的药物提供靶点建议和技术支撑。研究内容(1)抗登革病毒ASO靶点的设计与筛选。通过序列比对,我们在登革病毒基因组相对保守的区域选择10条长度为28bp的ASO候选靶点,同时利用靶向地中海贫血患者中基因组中发生突变的特异性序列作为无关靶点对照。分别将上述靶点合成相应的ASO靶点,同时在ASO靶序列的两端分别修饰吗啉代环和二氨基磷酸酯基团。随后,利用荧光定量PCR,在感染了登革二型病毒的Vero细胞模型中分别评价含有不同靶点的ASO对登革病毒载量的抑制效率。筛选出抑制病毒载量效率最高的反义寡核苷酸。(2)ASO抗登革病毒条件优化及效果评价。为了获得反义寡核苷酸最佳的抗登革病毒条件,我们分别对ASO抗登革病毒的最适剂量、最佳给药时间进行了评价。同时,我们利用病毒空斑实验,进一步验证了ASO对登革病毒活性的抑制。此外,为了验证其在不同细胞系中的抗病毒效果,我们分别在Vero,Hep G_2等细胞系中评价了ASO的抗病毒效率。(3)反义寡核苷酸对登革病毒各亚型抑制效果分析。为了进一步评估ASO对不同型别登革病毒复制的抑制效果,我们分别建立了登革一、三、四型病毒感染细胞模型,随后利用上述研究中筛选出的ASO分别对不同型别登革病毒的病毒载量进行抑制效率检测,评估其对于登革病毒各亚型的抑制效果。研究结果(1)筛选出了抗登革病毒效果最好的靶向UTR区域的反义寡核苷酸(后续简称为ASO-UTR)。用靶向登革病毒十个基因靶点的反义寡核苷酸以相同的浓度进行抗病毒实验,可以观察到ASO-UTR的抗病毒效果最好,ASO-UTR实验组细胞生长状态与细胞对照组相似,提示病感染较少,72h病毒载量下降了99.8%。(2)筛选出了反义寡核苷酸抗登革病毒最佳给药浓度,用不同稀释倍数的ASO-UTR进行抗病毒实验,Medullary thymic epithelial cells结果显示0.01μM,0.1μM,1μM,10μM浓度的ASO-UTR对登革二型病毒抑制效率分别为:0.01μM,84.46%±4.23%;0.1μM,97.48%±3.96%;1μM,99.58%±3.48%,10μM,99.97%±3.46%。可以看出,10μM浓度的ASO-UTR对病毒抑制效率最高,达到了99.97%±3.46%。(3)进行了不同给药时间抗病毒效果的差异性分析,以接毒时间为准,接毒后2h,6h和12h给药后,24h病毒抑制效率分别为:2h:99.88%±20.84%;6h:99.89%±20.84%;12h:98.99%±20.84%。48h病毒抑制效率分别为:2h:99.99%±26.23%;6h:99.98%±26.23%;12h:99.63%±26.23%。72h病毒抑制效率分别为:2h:99.94%±10.98%,6h:99.82%±10.98%;12h:98.78%±10.98%。得出结论为实际用药时间越早,效果越佳。(4)验证了ASO在不同细胞系中对于登革病毒均有抑制效果。在Vero细胞中,ASO-UTR对登革病毒的抑制效率为72h下降99.99%±10.66%。在Hep G_2细胞中,ASO-UTR对登革病毒的抑制效率为72h下降99.99%±29.89%。(5)验证了靶ASO-UTR对于登革病毒各亚型均有抑制效果。ASO-UTR对登革一型病毒的抑制效率为24h下降了98.69%±15.22%,48h下降了99.83%±12.03%,72h下降了99.99%±11.82%。ASO-UTR对登革三型病毒的抑制效率为24h下降了99.71%±21.14%,48h下降了99.96%±29.92%,72h下降了99.99%±8.26%。ASO-UTR对登革四型病毒的抑制效率为24h下降了99.75%±4.89%,48h下降了99.99%±13.45%,72h下降了99.99%±18.94%。研究结论本研究发现靶向登革病毒基因组UTR区域的ASO可以高效抑制登革病毒复制,该ASO在细胞模型中将登革病毒的病毒载量降低了99.99%±29.89%,且对selleck4种亚型的登革病毒均有抑制作用。本研究还探究了ASO的最佳使用剂量和给药时间。因此,本研究将为后续基于ASO的抗登革病毒药物的开发使用提供候选靶点和技术支持。