第一部分:共同性外斜视家系遗传基因的鉴定【目的】采用遗传学研究手段,通过收集共同性外斜视遗传家系和散发病例,挖掘和鉴定共同性外斜视的致病基因。【方法】1.本研究于2016年1月-2018年12月期间收集在云南省第二人民医院就诊的11个共同性外斜视家系(包括间歇性外斜视和恒定性外斜视)共58例成员selleck SAG的临床资料,采集4-5ml外周血/人备用。于2016年1月-2019年3月收集570例散发性共同性外斜视患者的临床资料,采集4-5ml外周血/人和部分患者手术切除的眼外肌备用。于2021年7月-2021年8月收集了220例正常人群的临床资料,采集4-5ml外周血/人备用。采用二代测序对11个共同性外斜视家系的28例患者和11例正常成员进行全外显子组测序,之后对测序数据进行生物学信息分析、筛选和比对。根据结果对来自11个共同性外斜视家系的58例成员进行Sanger测序验证和家系共分离分析。2.根据Sanger测序和家系共分离分析结果,选取4个候选基因及突变位点,在散发性共同性外斜视样本中进行Sanger测序,验证突变频率。3.根据散发样本验证结果,设计3个候选基因的捕获测序芯片,选取220例散发性共同性外斜视患者进行全外显子的捕获测序,以期发现候选基因新的突变位点。【结果】1.根据家系分析和测序结果显示,纳入研究的11个共同性外斜视家系均为常染色体显性遗传。家系共分离分析结果显示了8个可能致病的候选基因(包含12个突变位点):BBS1 c.163G>A(p.V55M);AUTS2 c.979C>T(p.R327C);GTDC2c.1181G>A(p.R394Q);COL4A2 c.1328C>G(p.P443R)、c.2051G>C(p.G684A)、c.4255A>G(p.M1419V)、c.4256 T>C(p.M1419T);SYNE1 c.1838C>T(p.S613F)、c.6992C>A(p.A2331更多D);LOXHD1 c.6413G>A(p.R2138Q);HERC2c.10474T>C(p.S3492P)和CDH3 c.2395G>A(p.A799T)。这12个突变均为错义突变,COL4A2不同位点的突变出现在3个家系中,SYNE1不同位点的突变出现在2个家系中。2.在552例散发性共同性外斜视样本的扩population genetic screening大验证中共发现候选基因BBS1c.163G>A(p.V55M)的5例相同位点突变;在496例散发样本中未找到AUTS2c.979C>T(p.R327C)相同位点突变;在422例散发样本中也未找到GTDC2c.1181G>A(p.R394Q)相同位点突变,以上3个基因位点突变在220例正常人群中均未检测到。在511例散发样本中发现SYNE1 c.1838C>T(p.S613F)的13例相同位点突变,且在220例正常样本中发现14例相同位点突变。3.通过对3个候选基因进行全外显子的捕获测序,在220例散发性共同性外斜视患者中鉴定出BBS1的另外3个突变(BBS1 c.1339G>A(p.A447T)、c.1660A>T(p.S554C)和c.1772C>T(p.A591V));AUTS2的另外7个突变(AUTS2c.661-143892T>G、c.*637G>A、c.*151T>C、c.2600A>G(p.K867R)、c.*173＿*176dup、c.-336del和c.*1821G>A);GTDC2的另外4个突变(GTDC2c.-346C>T、c.-259G>A、c.484G>A(p.D162N)和c.1195G>A(p.E399K));这些突变在220例正常人群中均未检测到。【结论】本研究首次鉴定出了共同性外斜视实现家系共分离的8个基因(BBS1、AUTS2、GTDC2、COL4A2、SYNE1、LOXHD1、HERC2和CDH3)及其突变位点,它们有可能是引起遗传性共同性外斜视的致病基因。第二部分:共同性外斜视家系遗传基因BBS1的功能机制研究【目的】根据共同性外斜视家系和散发样本的基因筛查与鉴定结果,选择候选基因BBS1作为研究目标,通过对共同性外斜视患者眼外肌样本研究和体外细胞功能实验,探索候选基因BBS1的4个突变位点(BBS1 c.163G>A(p.V55M),BBS1 c.1339G>A(p.A447T),BBS1 c.1660A>T(p.S554C)和BBS1c.1772C>T(p.A591V))的作用及影响。【方法】1.通过实时荧光定量方法对共同性外斜视患者眼外肌样本中BBS1的总RNA进行检测和分析,以查看候选基因BBS1在不同共同性外斜视患者中的表达量。2.通过构建候选基因BBS1野生型及4个突变位点的慢病毒载体质粒,转染293T细胞、ARPE-19细胞,提取RNA进行转录水平BBS1 m RNA的定量分析,提取总蛋白进行Western Blot分析,以查看目标突变位点在体外培养细胞中对转录和翻译水平的影响。3.在慢病毒载体质粒转染ARPE-19细胞后进行免疫共沉淀实验,以探索BBS1不同突变位点对BBSome复合物形成的影响。根据结果探讨候选基因BBS1在共同性外斜视中可能的致病机制。【结果】1.共同性外斜视患者眼外肌组织总RNA提取后RT-q PCR分析结果显示:患者眼外肌组织中BBS1野生型m RNA相对表达量在携带BBS1突变基因与不携带突变基因患者中无明显差异(P>0.05)。2.BBS1野生型及4个突变位点的慢病毒载体质粒转染293T细胞、ARPE-19细胞后RT-q PCR分析结果显示:BBS1野生型和突变型质粒的m RNA相对表达量无明显差异(P>0.05)。Western Blot分析结果显示:BBS1野生型和突变型质粒转染ARPE-19细胞后的蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)。3.免疫共沉淀结果显示,当BBS1发生V55M突变后,其与BBSome复合物中的BBS4、BBS8、BBS9蛋白结合能力下降,差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】BBS1的目标突变位点不影响RNA转录和蛋白翻译水平,但是BBS1-V55M突变削弱了BBS1蛋白与BBSome复合物中BBS4、BBS8和BBS9蛋白的结合。BBS1-V55M可能通过影响BBSome的数量、结构和(或)功能引发共同性外斜视。