标记免疫分析技术是当前免疫分析技术中最为活跃、发展最快的一个领域,其中非均相免疫分析是一种需要分离结合标记物和游离标记物的标记免疫分析技术,也是当前应用最广的免疫分析方法,如酶联免疫吸附测定(ELISA)等。固相化抗体是非均相免疫分析的核心试剂。通过化学键与固相载体偶联固定的抗体稳定性与牢固性远高于物理吸附固相化抗体,然而由于抗体分子内缺少特异性氨基酸残基,当前基于交联抗体分子内氨基酸残基的化学共价偶联是一种随机模式,难以控制抗体分子内参与偶联的氨基酸残基位点,偶联固定后抗体的免疫学活性及空间构型不均一,如果偶联位点发生在抗体Fab端,则抗体的抗原结合活性降低甚至丧失。发展特异性位点的抗体偶联固相化技术,对于进一步提高固相免疫分析的灵敏度与特异性具有重要意义。半胱氨酸(Cys)是唯一拥有侧链巯基(-SH)的天然氨基酸,抗体分子内无游离巯基,本论文围绕如何在天然抗体Fc区域共价修饰引入特异性巯基功能基团,为抗体的定向偶联固定提供特异性活性位点,开展相关研究工作,包括:设计、构建系列含光敏基团非天然氨基酸(4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸,Bpa)的光敏ZBpa-Cys重组肽突变体,利用光亲和标记技术,以光敏ZBpa-Cys突变体为“转换构件”介导巯基官能团靶向抗体Fc位点共价偶联,实现特异性功能基团对抗体Fc区域的体外修饰,继而以该修饰巯基为偶联官能团构建立体定向固相化抗体。具体研究内容包括:(1)光敏ZBpa-Cys重组肽突变体的设计、构建与表达Z亲和肽是金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)B结构域的衍生物,与IgG抗体Fc段特异性结合,自身不含半胱氨酸残基,本论文选择巯基(半胱氨酸残基提供)作为特异性功能基团通过光亲和标记技术实现对抗体Fc段的共价偶联修饰。在前期研究及相关文献基础上,通过PyMOL软件(1.0.0.0)模拟,选择Z亲和肽α1和α2螺旋中面对抗体Fc区域的12个氨基酸残基作为Bpa的替换插入位点,设计12个Bpa不同位点的光敏ZBpa-Cys突变体筛选库。分子生物学方法构建琥珀密码子(TAG)不同突变位点的12个pZTAG-Cys质粒表达载体,分别与pEVOL-pBpF质粒共转化E.coli BL21构建基因工程菌,遗传密码子扩展技术表达各光敏ZBpa-Cys突变体。质谱检测ZBpa-Cys突变体的胰蛋白酶酶解产物,鉴定Bpa是否在相应氨基酸残基位点替换插入到Z亲和肽序列中。通过正交设计优化基因工程菌表达条件,以固定化金属离子亲和层析(IMAC)技术纯化各ZBpa-Cys突变体。结果显示,设定的氨基酸密码子成功突变为琥珀密码子,各pZTAG-Cys质粒表达载体成功构建;通过遗传密码子扩展技术,12个不同氨基酸残基位点替换插入非天然氨基酸(Bpa)的ZBpa-Cys重组肽突变体在大肠杆菌表达体系均表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)均与理论值一致(9 kDa),质谱测定结果表明Bpa在设定的氨基酸残基位点替换插入到Z亲和肽肽链中。在本实验摇瓶培养条下,ZBpa-Cys突变体的优化表达条件为:基因工程菌过夜活化,以1:50转接于LB液体培养基,37℃、220 r/min培养3 h,然后加入终浓度3 mmol/L的Bpa和0.2%(w/v)阿拉伯糖继续培养0.5 h后,加入终浓度为0.25 mmol/L的IPTG,37℃、220r/min诱导表达4h;通过IMAC纯化各ZBpa-Cys突变体,可从1 L培养基的菌体中纯化得到20～30 mg目的蛋白。(2)光敏ZBpa-Cys重组肽介导Cys功能基团对IgG的光激发共价偶联修饰以17thZBpa-Cys与兔IgG光共价偶联为研究模型,从ZBpa-Cys与IgG物质的量之比、365 nm UV激发时间两个因素探讨、优化ZBpa-Cys对IgG的光共价偶联体系。采用F(ab’)2片段与17thZBpa-Cys对照实验、17thZBpa-Cys与IgG光偶联产物的木瓜蛋白酶酶切实验,分析ZBpa-Cys与IgG的共价偶联位点。以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对照考察UV照射对蛋白质活性的影响;以竞争ELISA测定光共价偶联前后兔IgG的抗原亲和常数。在优化光共价偶联体系下,以抗体共价偶联效率为指标,12个ZBpa-Cys突变体与兔IgG、小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3进行光偶联的匹配筛选。以小鼠IgG2a为研究模型,表面等离子共振(SPR)技术分析光偶联效率各不相同的ZBpa-Cys突变体与小鼠IgG2a亲和常数,探讨Bpa功能位点与光共价偶联的关联机制。结果显示,兔IgG与3倍及以上物质量的17thZBpa-Cys在4℃温育过夜结合,冰浴条件下365 nm UV激发照射120 min,IgG光共价偶联率可达到90%以上。F(ab’)2片段对照实验及光偶联产物酶解实验结果表明ZBpa-Cys与IgG发生共价偶联部位位于抗体Fc片段。EGFP的UV照射实验及抗体亲和常数测定结果表明,365 nm UV照射2 h,EGFP的荧光活性未受到显著影响,光偶联修饰后IgG的亲和常数近似于未修饰的IgG,表明光偶联修饰未显著影响抗体的抗原结合活性。在优化的光偶联条件下,利用Bpa功能位点不同的ZBpa-Cys突变体实现了免疫分析中常用的兔IgG、小鼠IgG的光共价偶联修饰:兔 IgG、小鼠 IgG2a、IgG2b及IgG3 选用17thZBpa-Cys,小鼠 IgG1 选用 32thZBpa-Cys,可实现高效光共价偶联,这种ZBpa-Cys在抗体Fc片段光共价偶联修饰的巯基化IgG称为IgG-CysFc。SPR结果显示,光敏ZBpa-Cys对IgG的亲和力与光偶联效率之间无正相关关系,影响光共价偶联效率的关键因素可能是ZBpa-Cys突变体中Bpa功能位点与IgG分子内供-H氨基酸残基的空间距离。(3)立体定向偶联固相化抗体的构建及其在免疫分析中的初步应用巯基化IgG(IgG-CysFc)为抗体的进一步偶联或固定提供了特异性活性偶联位点,通过巯基与马来酰亚胺基的特异性反应,实现IgG-CysFc与马来酰亚胺基功能化的固相载体偶联,构建立体定向固相化抗体。我们以聚苯乙烯(PS)微孔板及磁性微球(MNPs)两种固相载体分别构建立体定向固相化抗体,以癌胚抗原(CEA)检测为研究模型,通过微孔板ELISA及MNPs-based ELISA两种测定模式,与随机固相化抗体对比评价定向偶联固相化抗体的检测效能。微孔板ELISA测定模式中,Iselleck合成gG-CysFc(Rabbit anti-CEA IgG))与马来酰亚胺基功能化PS微孔板偶联,构建定向固相化抗体(IgG-CysFc/Mal-plate),以抗体吸附包被的PS微孔板为对照。MNPs-based ELISA测定模式中,先通过6-马来酰亚胺基己酸磺酸-N-琥珀酰亚胺酯(Sulfo-EMCS)对NH2-MNPs改性,在MNPs表面引入马来酰亚胺基(Mal-MNPs),继而介导IgG-CysFc(Rabbit anti-CEAIgG)与 Mal-MNPs 的偶联,构建抗体定向偶联的 IgG-CysFc@MNPs;以IgG与NH2-MNPs戊二醛两步偶联制备的IgG@MNPs为对照,BCA及SDS-PAGE分析偶联量与偶联特异性后,考察IgG-CysFc@MNPs及IgG@MNPs检测CEA应用效果,并从特异性、稳定性及抗血清IgG干扰等方面进行IgG-CysFc@MNPs-based ELISA的方法学评价。结果显示,本实验条件下,IgG经戊二醛两步法与NH2-MNPs偶联,其最大偶联量约 60 μg/mg;IgG-CysFc在 Mal-MNPs 表面的最大偶联量约 50 μg/mg,变性 SDS-PAGE结果表明IgG-CysFc经修饰的巯基与Mal-MNPs偶联。微孔板ELISA模式中,定向偶联抗体(IgG-CysFc/Mal-plate)的最低检测限为0.7 ng/mL,较随机固相化(吸附包被)抗体检测灵敏度(2.0 ng/mL)提高3倍。以IgG-CysFc@MNPs、www.selleck.cn/products/DAPT-GSI-IXIgG@MNPs为固相载体的 MNPs-based ELISA 检测 CEA,IgG-CysFc@MNPs 的最低检测限为 0.02 ng/mL,较抗体戊二醛偶联 IgG@MNPs 的灵敏度(0.4 ng/mL)提高 20 倍。IgG-CysFc@MNPs-based ELISA测定CEA的日内、日间加标回收率分别为103.25%～107.65%和97.33%～101.81%,相对标准偏差分别为 1.93%～6.79%和 5.54%～10.6%,表明 IgG-CysFc@MNPs-based ELISA具有良好的稳定性和重复性;抗血清干扰实验表明该方法不受血清内源性IgGs干扰,克服了 IgG亲和肽通过生物亲和方式定向固定抗体可逆结合的应用瓶颈。以IgG-CysFc@MNPsBiomimetic water-in-oil water-based ELISA测定5倍稀释度的临床血清样本,其测定结果与临床检测值的相对偏差绝对值均在10%以内,且两者之间具有良好的相关性(R2=0.9901),显示IgG-CysFc@MNPs在免疫学检验中具有潜在的应用价值。综上所述,本论文以光敏ZBpa-Cys重组肽为“转换构件”,通过构建多个Bpa功能位点的ZBpa-Cys突变体介导巯基对兔IgG、小鼠IgG的光共价偶联,有机融合了亲和肽亲和结合IgG的位点特异性和化学共价偶联的牢固性优点,实现特异性功能基团对抗体Fc区域的共价修饰,继而构建立体定向固相化抗体,有效提高了免疫分析的检测灵敏度,为新型免疫诊断试剂的开发奠定了实验基础。本论文所提出的设计思想,可介导不同功能基团对抗体Fc位点共价修饰,结合固相载体表面修饰技术,除了在抗体芯片、免疫传感器等领域具广泛的应用前景外,也可以介导治疗性药物与抗体Fc位点共价偶联,对于抗体偶联药物等靶向递药相关研究也具有重要借鉴价值。