目的:梳理经典方剂独活寄生汤在现代医学中的应用,挖掘独活寄生汤治疗膝关节骨性关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)的研究热点和前沿,评价各种治疗方式之间的优劣,并探究加味独活寄生合剂(Jiawei Duhuo Jisheng Mixture,JDJM)对KOA滑膜Wnt/β-catenin信号通路的影响及对KOA关节滑膜和软骨的保护作用。方法:1.基于可视化工具分析独活寄生汤的现代用药特点及防治KOA的研究热点(1)检索5个数据库获取文献,应用描述性统计分析法,对有关独活寄生汤现代应用的相关文献数据进行汇总,将文献的发文年份、期刊杂志、应用剂型与治疗疾病情况进行描述分析。(2)应用共现分析的方法,对相关文献的作者、机构与关键词进行提取分析,找出该领域的核心研究者、核心团队与研究机构。(3)应用聚类分析的方法,对独活寄生汤治疗KOA的相关文献关键词进行聚类分析,找出该研究领域中的基本知识结构,并绘制时间线视图谱,直观的展示出该研究领域的演化过程。(4)应用关键词突现分析的方法,对独活寄生汤治疗KOA的相关文献的关键词进行突现分析,挖掘该研究领域的热点与前沿。2.基于网状Meta分析的独活寄生汤治疗KOA的临床评价研究在第一部分检索文献的基础上进行筛选,阅读全文获得需要的信息构建数据集;质量评价后,采用网状关系图对不同干预措施治疗KOA的总有效率进行评价,接着采用R语言下绘制各结局指标的网络证据关系图和排序概率条形图,对各种干预措施进行评价。3.JDJM调控兔KOA滑膜成纤维细胞Wnt/β-catenin信号通路的体外实验采用改良Hulth造模法建立兔KOA模型,鉴定造模成功后在无菌条件下分离并培养兔KOA滑膜成纤维细胞。给与不同体积分数JDJM含药血清干预后,采用ELISA法检测滑膜成纤维细胞培养上清液中MMP-7、CyTissue biopsyclin D1表达水平,Western Blot法检测滑膜成纤维细胞中Wnt3a、β-catenin和COX-2蛋白表达,RT-PCR法检测滑膜成纤维细胞中Wnt3a、β-catenin、MMP-7、Cyclin D1和COX-2的m RNA表达,探讨JDJM对兔KOA滑膜成纤维细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响。4.JDJM调控兔KOA滑膜Wnt/β-catenin信号通路的体内实验将60只新西兰健康大白兔随机分为空白对照组(15只)和造模组(45只),将造模组造模后随机分为模型对照组(15只)、阳性对照组(15只)和中药组(15只),分别给予生理盐水、塞来昔布和JDJM进行干预,灌胃后2、4、8周处死。对一般情况进行观察;对膝关节直径进行测量;光镜下,对膝关节滑膜和软骨的显微结构进行观察,Western Blot法检测关节滑膜Wnt3a、β-catenin、MMP-7、Cyclin D1和COX-2的蛋白表达,RT-PCR法检测关节滑膜Wnt3a、β-catenin、MMP-7、Cyclin D1和COX-2的m RNA表达,探讨JDJM对兔KOA软骨、滑膜的保护作用及对滑膜Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果:1.基于可视化工具分析独活寄生汤的现代用药特点及防治KOA的研究热点本研究共纳入了1603篇文献。近十年中,2017年发文量最多为202篇;这些文献共刊登于260种期刊上,其中核心期刊66种;《中医临床研究》杂志的发文量最多为85篇;临床中最常用的药物剂型为汤剂;独活寄生汤治疗疾病涉及骨科、内科、妇科、眼科、皮肤科等,其中应用于KOA的文献最多为475篇。独活寄生汤治疗KOA的研究团队中影响力前三的团队分别是以刘献祥教授、卢敏教授、陈少青为核心的团队。福建中医药大学中西医结合研究院、福建中医药大学和福建省中西医结合老年性疾病重点实验室在研究机构中排名前三,湖南中医药大学第一附属医院最早发表相关文献,各个科研团队之间联系并不密切。关键词共现分析:该领域的研究类型主要是临床观察型研究;疼痛评分和炎性因子水平是最常用的疗效评价指标;治疗方案上独活寄生汤最常联合针灸、关节腔注射和非甾体抗炎药进行治疗;软骨细胞是实验最常研究的对象。关键词聚类后共得到8个聚类,分别为Cluster 0(软骨细胞)、Cluster 1(疼痛评分)、Cluster 2(塞来昔布)、Cluster 3(美洛昔康)、Cluster 4(针灸)、Cluster 5(CRP)、Cluster 6(临床经验)、Cluster 7(玻璃酸钠);关键词突现分析共得到14个突现关键词,分别为临床观察(2012～2013)、临床经验(2012～2013)、中药熏蒸(2012～2016)、中药外敷(2012～2013)、尼美舒利(2012～2013)、牵引(2012～2014)、玻璃酸钠(2013～2016)、功能锻炼(2013～2016)、滑膜炎(2014～2016)、运动疗法(2015～2017)、痹证(2016-2018)、炎性因子(2019～2021)、作用机制(2019～2021)、骨代谢(2019～2021)。2.基于网状Meta分析的独活寄生汤治疗KOA的临床评价研究本部分共纳入了37篇文献,其中英文文献1篇,中文文献36篇。37篇文献均报道了治疗有效率,15篇文献报告了不良反应。37篇文献共涉及干预措施有17种,分别为“独活寄生汤”“氨基葡萄糖”“塞来昔布胶囊”“独活寄生汤+针灸”“双氯芬酸钠”“布洛芬”“独活寄生汤+氨基葡萄糖”“美洛昔康”“玻璃酸钠”“独活寄生汤+功能锻炼”“独活寄生汤+玻璃酸钠”“独活寄生汤+外敷/熏洗”“双醋瑞因”“冲击波”“吲哚美辛”“针灸”“独活寄生汤+冲击波”;通过综合比较不同干预措施PASI评分和总有效率的OR值,对疗效排序如下:D(独活寄生汤+针灸)>J(独活寄生汤+功能锻炼)>L(独活寄生汤+外敷/熏洗)>K(独活寄生汤+玻璃酸钠)>Q(独活寄生汤+冲击波)>G(独活寄生汤+氨基葡萄糖)>N(冲击波)>A(独活寄生汤)>P(针灸)>I(玻璃酸钠)>M(双醋瑞因)>O(吲哚美辛)>B(氨基葡萄糖)>F(布洛芬)>E(双氯芬酸钠)>C(塞来昔布)>H(美洛昔康)。3.JDJM调控兔KOA滑膜成纤维细胞Wnt/β-catenin信号通路的体外实验(1)术后5周LGK-974细胞培养可成功复制兔KOA模型。(2)ELISA检测结果显示,培养48和72小时后,不同体积分数JDJM含药血清组的Cyclin D1和MMP-7蛋白含量明显较同体积分数的正常血清组要低(P<0.05);在培养72小时后20%体积分数的JDJM血清组的Cyclin D1、MMP-7蛋白含量最低,与抑制剂组抑对比无明显差异(P>0.05)。(3)Western Blot检测结果显示,在培养48和72小时后,不同体积分数JDJM血清组的Wnt3a、β-catenin和COX-2蛋白含量明显较同体积分数的正常血清组要低(P<0.05),不同体积分数JDJM血清组的β-catenin和COX-2蛋白含量组间对比存在差异(P<0.05),20%体积分数的JDJM血清组<10%体积分数的JDJM血清组<5%体积分数的JDJM血清组。(4)RT-PCR检测结果显示,在培养48和72小时后,不同体积分数JDJM血清组的Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、MMP-7和COX-2 m RNA表达水平明显较同体积分数的正常血清组要低(P<0.05),不同体积分数JDJM血清组的β-catenin和COX-2 m RNA表达水平组间对比存在差异(P<0Belnacasan.05),其中20%体积分数的JDJM血清组m RNA表达水平显著低于其他体积分数的JDJM血清组(P<0.05)。4.JDJM调控兔KOA滑膜Wnt/β-catenin信号通路的体内实验(1)造模后兔精神状况变差、进食量、活动量减少、造模侧大腿保护性蜷缩。造模后2天至5周,精神状况逐渐好、进食量、活动量逐渐接近正常,部分仍有跛行。(2)造模后兔膝关节直径增加(P<0.05),经JDJM治疗后肿胀度逐渐好转,膝关节直径在4周时接近正常水平(P>0.05)。(3)造模后,可观察到膝关节滑膜增生,色泽呈亮黄白相间且质地较硬,可见大量瘀血附着;随着时间增加,滑膜颜色呈暗黄色,且可见纤维性增生,质地硬度增加。经JDJM灌胃后滑膜颜色变浅,增生情况好转。关节软骨内髁软骨表面异常粗糙,触摸不光滑,软骨颜色暗色、不透亮,局部可见软骨变薄或缺失,底部可见充血,关节液浑浊;经JDJM干预后表面尚平整,触摸光滑度尚可,软骨呈现透亮。(4)造模后,镜下可见滑膜组织表层细胞分布不均匀,滑膜内衬层细胞大量增生,可达5-7层,细胞排列明显紊乱,可见大量炎性细胞浸润,血管和纤维组织明显增生,随着时间的增加炎性细胞数量增加,血管和纤维组织增生严重。中药干预后内衬层细胞数量减少,炎性细胞减少,纤维组织增生情况逐渐改善。软骨镜下可见软骨厚度变薄,软骨表面裂隙明显,部分可达辐射区,软骨细胞分布不规则,软骨细胞数量减少,潮线消失,部分可见血管通过。随着时间增加,也可见部分软骨剥脱,软骨下骨外露。中药干预后见软骨表面粗糙不平,软骨细胞增生向损伤区爬行,软骨厚度变薄,潮线模糊。随着灌胃时间增加,软骨修复明显,潮线基本清晰可见,但整体厚度仍较薄。(5)造模后,与空白对照组相比,各组滑膜组织中Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、MMP-7和COX-2 m RNA表达水平较高(P<0.05),并且随着时间增加大多呈升高趋势;经JDJM灌胃后均逐渐下降,中药组与模型对照组相比结果有统计学差异(P<0.05),与阳性对照组、空白对照组对比结果无统计学差异(P>0.05)。(6)造模后,与空白对照组相比,各组滑膜组织中Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、MMP-7和COX-2蛋白含量较高(P<0.05);经JDJM灌胃后均逐渐下降,在2周后,中药组的Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、MMP-7和COX-2蛋白含量已经接近空白对照组(P>0.05)。结论:1.独活寄生汤在现代疾病的治疗上仍呈现出一定的优势,应当充分的探索其价值,为中医药现代化及中医药的传承、创新、发展做出贡献。独活寄生汤的相关文献发表数量在逐年上升后稍有回落,现大致呈平稳状态,意味着该领域研究逐渐进入稳定发展阶段。2.独活寄生汤在骨科的应用最为广泛,尤其在治疗KOA上更显现出相当的优势。福建中医药大学刘献祥教授团队和湖南中医药大学卢敏教授团队在独活寄生汤治疗KOA领域的研究较为成熟,可以成为该领域国内外学术交流与合作的首先考虑对象。3.在探索独活寄生汤治疗KOA的机制研究中,先前热点为临床观察证实该方的临床疗效;当前的热点为验证该方的作用机制,主要关注评价软骨的变化;接下来趋势可能转向滑膜及“滑膜-软骨”交互机制对KOA的影响,研究方法以实验验证为主。4.独活寄生汤能够有效的治疗KOA,且副作用较少;单一药物疗法中独活寄生汤具有显著的治疗效果,综合疗法中独活寄生汤联合针灸的效果最佳;与单一疗法对比,联合治疗更能提高临床疗效。5.通过改良Hulth法可成功建立兔KOA模型,用于相关机制的研究。6.Wnt/β-catenin信号通路在KOA中呈激活状态,下调Wnt/β-catenin信号通路能够抑制滑膜成纤维细胞的增殖及炎症反应。7.KOA关节软骨损伤与滑膜密切相关。8.JDJM能够抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,具有改善兔KOA症状、修复关节软骨、抑制滑膜增生、抑制炎性因子分泌的作用。